豬滲出性皮炎病原的分離鑒定*

張樂宜,陳亞強(qiáng),蔡汝健,郝永清,宋長(zhǎng)緒*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,廣東廣州510640)

豬滲出性皮炎(Exudative epidermitis,EE)是一種急性、高度接觸性的傳染病,患豬以急性全身性滲出性皮炎以及敗血癥為主要特征,該病又稱溢脂性皮炎或煤煙病。豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)是引起豬滲出性皮炎的主要病原菌之一[1]。本病主要感染5日齡～6日齡的初生哺乳仔豬和斷奶的仔豬。目前已發(fā)現(xiàn)引起該病的葡萄球菌包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、松鼠源葡萄球菌以及豬葡萄球菌等。但在臨床上最為常見的病原為豬葡萄球菌。對(duì)該病研究已經(jīng)有160多年的歷史[2]。S.hyicus在自然界中較廣泛存在,在豬、牛、家禽皮膚上都可以分離到該菌,正常情況下對(duì)動(dòng)物是非致病的,但是在環(huán)境條件改變(例如破裂和損傷的皮膚黏膜以及免疫接種等)時(shí)能夠?qū)е乱恍┎溉樽胸i發(fā)生滲出性皮炎。S.hyicus的菌株可以分成有毒力型和無毒力型[3]。在患有EE的仔豬皮膚、心臟分離到帶毒S.hyicus菌株的幾率最高,其他臟器分離率相對(duì)較低[4]。

豬滲出性皮炎在臨床上經(jīng)常發(fā)生,對(duì)豬場(chǎng)的生產(chǎn)影響較大,特別是華南地區(qū)高熱、高濕的氣候條件下,造成的損失特別大。國內(nèi)對(duì)豬滲出性皮炎的病例報(bào)道較多,但對(duì)病原進(jìn)行深入細(xì)致分離和研究的較少。本研究對(duì)發(fā)生在華南地區(qū)的一例較嚴(yán)重豬滲出性皮炎的病豬進(jìn)行了診斷,并進(jìn)行了病原分離、鑒定和致病力試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 廣東省增城某豬場(chǎng)送檢疑似患有豬滲出性皮炎的病豬。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基、革蘭染色液(廣東環(huán)凱微生物試劑有限公司)、LB液體培養(yǎng)基、葡萄球菌屬微量生化鑒定管(杭州天和微生物試劑有限公司)、ExTaq酶、DNA凝膠回收試劑盒(廣州美津生物技術(shù)有限公司)、小量質(zhì)粒抽提試劑盒(廣州美津生物技術(shù)有限公司)、PCR 2.1-TA克隆載體(廣州英韋創(chuàng)津有限責(zé)任公司)以及其他國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)2周齡雌性昆明小鼠12只,購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.4 引物 葡萄球菌屬16 S rRNA基因的通用引物:P1ATACATGCAAGTCGAGCGAACAG;P2:GCT TCGAATTAAACCACATGCTC,預(yù)期擴(kuò)增片段895 bp[5]。gap基因的通用引物:P1:ATGGTT TTGGTAGAATTGGTCGT TTA;下游引物P2:GACATT TCGT TATCATACCAAGCTG,預(yù)期目的片段大小為931 bp[6]。引物由Invitrogen trading(Guangzhou)Co.Ltd合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌采取病豬心臟、肝、脾、肺臟等病料,分別接種血瓊脂平板,37℃培養(yǎng)12 h～24 h,挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭染色,鏡檢,選取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純培養(yǎng),同時(shí)接種肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗(yàn) 對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行尿素,蔗糖,精氨酸雙水解酶,木糖,乳糖,甘糖,木醇,麥芽糖,蕈糖,甘醇,乙酰葡胺,硝酸鹽還原,蜜二糖,果糖,VP,山醇等16項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定,37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 用北京天壇藥敏試紙片對(duì)分離到的豬葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.4 PCR檢測(cè)

1.2.4.1 全基因組DNA的提取 挑取單個(gè)菌落加入5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,次日取1 mL～3mL菌液,12 000 r/min離心2 min,用細(xì)菌DNA小量抽提試劑盒抽提全基因組。

1.2.4.2 PCR擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板,反應(yīng)體系如下:Premix Taq(5 U/μ L)10 μ L,上下游引物各1 μ L(10 pmol/μ L),模板DNA 2 μ L,加滅菌去離子水至25 μ L。gap基因PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

1.2.4.3 測(cè)序 用12 g/L的瓊脂糖凝膠回收目的片段,產(chǎn)物純化后送上海英俊生物技術(shù)有限公司(廣州分公司)測(cè)序。同時(shí)對(duì)測(cè)出的基因序列在NCBI上與國外已發(fā)表的16 S rRNA、gap基因序列進(jìn)行進(jìn)行Blast比對(duì)和同源性分析。

1.2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將分離的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)18 h～24 h后,5 000 r/min離心5 min,收集上清和沉淀,沉淀用PBS重懸,用SPF級(jí)昆明小鼠做致病性試驗(yàn),隨機(jī)分為3組,每組4只,一組為PBS對(duì)照,其余兩組分別注射上清和菌液,注射量為250 μ L/只,18 h后觀察記錄臨床癥狀和死亡時(shí)間。無菌采取死亡小鼠目寸光的肝、肺、脾、心臟病料,涂片鏡檢,同時(shí)做細(xì)菌的分離鑒定,再用PCR進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

發(fā)病小豬全身出現(xiàn)一層薄的、灰棕色或黑色的片狀滲出物,觸摸患豬皮膚溫度增高,被毛粗亂無光澤,顫抖,站立不穩(wěn)。剖檢可見頜下淋巴結(jié)呈大理石樣變,肺臟出現(xiàn)淤血伴有間質(zhì)性肺炎。腎臟有大小不等的出血點(diǎn)。

2.2 細(xì)菌分離及生化鑒定

挑取血平板上的菌落涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢,分離菌為革蘭陽性,圓形,呈葡萄串狀排列。純化的細(xì)菌劃線于血瓊脂平板上培養(yǎng)18 h,可見白色、濕潤、光滑、隆起的不溶血的圓形菌落。不在麥康凱培養(yǎng)基生長(zhǎng),生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 豬葡萄球菌生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of Staphylococcus hyicusbiochemistry assay

2.3 藥敏試驗(yàn)

分離菌對(duì)頭孢拉定、新生霉素、米諾環(huán)素、慶大霉素、頭孢噻呋、頭孢唑啉等高度敏感;對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、萬古霉素、氯霉素、卡那霉素中度敏感;對(duì)青霉素、鏈霉素、四環(huán)素產(chǎn)生耐藥。

2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用葡萄球菌屬16 S rRNA、gap基因的通用引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳,分別擴(kuò)增出一條約895 bp和931 bp大小的片段,與預(yù)期大小相符(圖1、圖2)。

2.5 致病性試驗(yàn)

攻毒12 h后,攻菌組小鼠肉眼可見在面部和背部皮膚出現(xiàn)大量紅色囊泡,精神萎靡,皮膚有炎性滲出,隨后皮膚糜爛,結(jié)痂,剖檢可見肺臟淤血。上清組無明顯癥狀;PBS對(duì)照組無癥狀。攻菌18 h后,攻菌組小鼠全部死亡;上清組無明顯癥狀;PBS對(duì)照組無癥狀。感染小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鏡檢:革蘭染色后顯微鏡下可以看到均勻、呈葡萄串狀的革蘭陽性球菌,PCR鑒定呈陽性。

表2 豬葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)Table 2 Drug sensitivity trial of Staphylococcus hyicus

圖1 16 S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of 16 S rRNA gene amplification

圖2 gap基因擴(kuò)增結(jié)果 Fig.2 The results of gap gene amplification

3 討論

葡萄球菌是一種常在菌,可分為19個(gè),而豬葡萄球菌被認(rèn)為是豬滲出性皮炎的主要病原。臨床上仔豬通常在感染后4 d～6 d發(fā)病[8]。臨床癥狀早期為在眼睛、面頰、口、耳周圍及腹部被毛處出現(xiàn)紅斑,3 d～5 d可擴(kuò)展到全身各處。皮膚滲出物增多,與皮脂、皮屑及污垢形成厚痂皮,強(qiáng)行剝離露出附著帶血的漿液或膿性分泌物的紅色創(chuàng)面。發(fā)病嚴(yán)重的小豬體重迅速減輕并會(huì)在24 h死亡,輕度感染的小豬皮膚變黃,被毛較多、粘連,只在腋部或肋部,靠近面部、頸部損傷處或鄰近交合處出現(xiàn)少數(shù)滲出物斑塊[9]。本試驗(yàn)根據(jù)臨床癥狀初步鑒定為豬滲出性皮炎,并且根據(jù)生化鑒定初步判定其病原為豬葡萄球菌。

本試驗(yàn)通過葡萄球菌16 S rRNA、gap基因的通用引物進(jìn)行葡萄球菌鑒定[8],對(duì)分離到的細(xì)菌DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到了與預(yù)期大小相符的目的條帶。在NCBI上經(jīng)Blast進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)利用16 S rRNA基因同屬間(如Staphylococcus hyicus、S.delphini、S.pseudintermedius)等核苷酸同源性為97%～100%,難以界定該菌株屬于哪個(gè)種。有學(xué)者認(rèn)為16 S RNA基因是鑒定葡萄球菌屬的標(biāo)準(zhǔn),研究發(fā)現(xiàn)該方法存在一些弊端,只能將細(xì)菌鑒定到屬,不能鑒定到亞種[10-11]。另外,還發(fā)現(xiàn)以GenBank上豬葡萄球菌16 S RNA基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,PCR擴(kuò)增不僅能擴(kuò)增出Staphylococcus hyicus,其他幾種葡萄球菌也能擴(kuò)增出目的條帶;而gap基因與其他種間的差異性明顯,為82%～99%,與GenBank上已收錄的基因登錄號(hào)AF495492的核苷酸同源性為99%。最后確定了此毒株是豬葡萄球菌。由于葡萄球菌極易對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥,所以對(duì)分離菌株做藥敏試驗(yàn)來選擇治療藥物是非常必要的,同時(shí)測(cè)定分離菌株對(duì)各種消毒藥物的抵抗力也是很有必要的[12]。本試驗(yàn)根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果,分離的菌株對(duì)頭孢拉定、新生霉素、米諾環(huán)素、慶大霉素、頭孢噻呋等高度敏感;對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、萬古霉素、氯霉素、卡那霉素中度敏感;對(duì)青霉素、鏈霉素、四環(huán)素產(chǎn)生耐藥。因此,可初步得出由此毒株引起的滲出性皮炎藥物首選頭孢拉定、新生霉素、米諾環(huán)素、慶大霉素、頭孢噻呋。

由于豬葡萄球菌廣泛存在于自然界和豬體的表面,所以要徹底根除本病幾乎是不可能的,但通過積極的預(yù)防則能控制或減少本病的發(fā)生[13]。為了控制本病的發(fā)生,首先要切斷主要的傳染源,對(duì)病豬不但要早發(fā)現(xiàn),早隔離和及時(shí)治療,而且對(duì)病豬污染的環(huán)境和用具等進(jìn)行徹底的消毒,同時(shí)對(duì)與病豬有接觸的豬要進(jìn)行預(yù)防性治療[14]。其次要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,提高豬體的抵抗力,防止常存在于環(huán)境中的病原菌乘虛而入。特別需要注意的是皮膚損傷,所以防止外傷是關(guān)鍵[15]。如果發(fā)生了局部損傷應(yīng)立即進(jìn)行處治,防止該病的進(jìn)一步發(fā)展。對(duì)已發(fā)生嚴(yán)重腎臟損害的病豬治療常難以奏效,最好淘汰。

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