豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立*

任夫波,張 志,張麗麗,楊若松,3,韓 艷,張燕霞,李曉成*,單 虎

(1.青島農業(yè)大學,山東青島266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東青島266032;3.西北農林科技大學,陜西楊凌712100)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是黃病毒(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員,其基因組為單股正鏈RNA,長約12.5 kb,含一個大的開放閱讀框(ORF),兩側為高度保守的5′和3′非編碼區(qū),臨床癥狀可表現(xiàn)為急性、亞急性、慢性和非典型性,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物傳染病,我國亦將其列為一類動物傳染病[1]。近年來隨著免疫接種的不斷加強,我國豬瘟的流行和發(fā)病特點發(fā)生了很大的變化,自然病例中常見的非典型、溫和型和亞急性已成為我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大隱患。因此,建立一種特異、敏感、快速的檢測豬瘟野毒的診斷方法是必要的。

目前國內對CSFV的傳統(tǒng)診斷方法包括免疫熒光試驗、病毒分離培養(yǎng)、動物接種試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、血清學試驗等為CSFV的鑒定和診斷提供了有效的手段[2-6]。但這些方法在特異性、敏感性以及時效性等方面都有各自的不足,不適用于CSFV感染的早期快速診斷。

近年來發(fā)展起來的實時熒光定量PCR(realtime fluorescent quantitative PCR)技術能快速檢測極微量的病毒核酸,而且能準確確定樣品中病毒的拷貝數(shù),操作方便,耗時短,結果直觀,因而迅速在醫(yī)學、農業(yè)等領域得到了廣泛應用。在國外熒光定量PCR技術已用于CSFV的定量檢測[7-8]。本研究利用一對特異性引物及TaqMan熒光探針建立了一種能快速、特異、靈敏檢測CSFV的實時熒光定量PCR方法,以期為CSFV的早期快速診斷提供幫助,可直接用于臨床病料的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 熒光定量PCR儀器,7300型,ABI公司生產(chǎn);臺式高速冷凍離心機:Sigma 1-15型,Sigma公司生產(chǎn);PCR儀,2720 Thermal Cycler型,ABI公司生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng),英國SYNGENE公司產(chǎn)品;YX智能型全自動立式電熱蒸汽壓力消毒器,上海三申醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn);超低溫冰箱,日本三洋產(chǎn)品;微量移液器,Finnpipette公司產(chǎn)品;Tip槍頭、EP管、PCR反應管,Axygen公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 Trizol LS Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;AMV(5 U/μ L)、HPRI RNA(40 U/μ L)、DEPC處理水、Ex Taq(5 U/μ L)、dNTP(2.5 mmol/L)、EcoRⅠ(15 U/μ L)限制性內切酶均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pGEMTeasy載體為Promega公司產(chǎn)品;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司;瓊脂糖為西班牙進口分裝產(chǎn)品;其他所用試劑為進口或國產(chǎn)分析純。DH5a大腸埃希菌由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心保存。

1.1.3 病毒 豬瘟病毒(Shimen株),豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV),牛病毒性腹瀉病毒(BVDV),豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),偽狂犬病毒(PRV),豬圓環(huán)病毒1型(PCV-1),豬圓環(huán)病2型(PCV-2),豬細小病毒(PPV)。豬瘟病毒YN33,BJ9,SX6(2.1、2.2和2.3基因亞群)均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設計 以高度保守的5′端非編碼區(qū)為參考,用Premier 5.0軟件,設計并選出一對引物和一條TaqMan探針,其序列如下:CSFV-5UTR-F:5′-CTAAGT CCT GAGTAC AGG ACA-3′;CSFV-5UT R-R:5′-CTA AGG TGT GAC T TG GGC ATA-3′;TaqMan probe:FAM-5′-TAG T TC GAC GTG AGC AGA-3′-TAMARA,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 陽性標準品的制備 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心檢測室曾經(jīng)構建的含有豬瘟強毒基因組5′端非編碼區(qū)的重組質粒,作為熒光定量PCR的標準品,在紫外分光光度計OD260測定光吸收值,定量后稀釋至1.0×108拷貝/μ L,置—20℃保存,用前10倍倍比稀釋。

1.2.3 熒光定量PCR法的建立

1.2.3.1 熒光定量PCR反應體系及優(yōu)化 反應體系為25 μ L:10×PCR buffer 2.5 μ L,dNTPs(10 mmol/L),上下游引物(10 pmol/L)0.5 μ L,AMV(5 U/μ L)0.5 μ L,HPRI(40 U/μ L)0.5 μ L,Ex Taq(5 U/μ L)0.5 μ L,CSFV-Probe(20 pmol/L)0.4 μ L,模板RNA 3 μ L,用超純水補足。反應條件:50℃30 min;95℃2 min,95℃15 s,52℃30 s,45個循環(huán)。退火延伸時檢測熒光信號。檢測結束根據(jù)噪音情況設定和調整基線及閾值,根據(jù)熒光曲線和Ct值初步判斷結果。采用矩陣法對引物濃度、探針濃度進行最佳配比篩選,以獲得最低的Ct值和較高的熒光強度增加值(vRn)。

1.2.3.2 標準曲線的建立 用中國動物衛(wèi)生與流行病學中心檢測室構建的含有豬瘟病毒基因組5′端非編碼區(qū)的重組質粒,作為標準品,10倍倍比稀釋成為模板,1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝/μ L,進行熒光定量PCR,以起始模板數(shù)的對數(shù)為X軸,Ct值為Y軸作回歸曲線,建立CSFV檢測的標準曲線。

1.2.3.3 靈敏性試驗 標準品以10倍倍比稀釋,取濃度范圍在1.0×1.00～1.0×107拷貝/μ L標準品,用建立的熒光定量PCR方法進行檢測,以檢測為陽性的最低濃度確定為該方法的檢測靈敏度。

1.2.3.4 特異性試驗 為了評價熒光定量PCR方法在檢測CSFV的特異性,用建立的熒光定量PCR檢測豬瘟病毒Shimen株、HCLV、BVDV、PRRSV、PRV、PCV-1、PCV-2、PPV以及中國動物衛(wèi)生與流行病學中心檢測室分離的豬瘟病毒YN33,BJ9和SX6(2.1、2.2和2.3基因亞群),以確定反應特異性。

1.2.3.5 重復性試驗 分別取等量的3份不同滴度(103、104、105拷貝/μ L)的標準品進行熒光定量PCR檢測,每份樣品作5個重復。

1.2.3.6 應用性檢測 隨機抽取來自湖南、福建、廣西、遼寧等地發(fā)病廠的組織樣品150份,用建立的熒光定量PCR法檢測,同時用套式PCR法進行檢測,并比較二者的陽性檢出率。

2 結果

2.1 測序鑒定

將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序,經(jīng)序列分析為豬瘟病毒5′端非編碼區(qū)序列。

2.2 優(yōu)化的熒光定量PCR反應條件

反應體系為25 μ L,10×PCR buffer 2.5 μ L,dNTPs 2.0 μ L(10 mmol/L),上下游引物(10 pmol/L)0.5 μ L,禽源反轉錄酶(AMV 5 U/μ L)0.2 μ L,RNA酶抑制劑(HPRI 5 U/μ L)0.3 μ L,Ex Taq聚合酶(40 U/μ L)0.3 μ L,CSFV-Probe(10 pmol/L)0.2 μ L,模板RNA 3 μ L,用超純水補足。反應條件:50℃30 min;95℃2 min,95℃15 s,52℃30 s,40個循環(huán)。

2.3 熒光定量RT-PCR標準曲線的建立

通過對熒光定量PCR各條件進行優(yōu)化后,得出檢測CSFV的擴增曲線(圖1)和標準曲線(圖2)。標準曲線方程:Ct=—2.896 logCO+32.350,樣品拷貝數(shù)的對數(shù)值(logCO)與Ct值之間有良好的線性關系。

2.4 敏感性

以10倍倍比稀釋的標準質粒(1.0×107拷貝/μ L～1.0×101拷貝/μ L)為模板進行擴增的熒光曲線見圖1.0×101拷貝/μ L仍有熒光曲線,表明該方法檢測靈敏度為1.0×101拷貝/μ L。

2.5 特異性

采用優(yōu)化好的體系檢測豬瘟標準強毒(Shimen株),HCLV和本實驗室分離的YN33、BJ9和SX6,同時常規(guī)提取BVDV、PRRSV、PRV、PCV-1、PCV-2、PRV和PK-15細胞核酸進行檢測,并設空白對照。結果CSFV各基因亞群均有熒光響應,除此之外均無熒光響應,表明本方法具有良好的檢測特異性。

2.6 重復性

統(tǒng)計結果顯示,3份豬瘟病毒陽性樣品5次檢測的Ct值變異系數(shù)均少于5%(表1),表明本檢測方法的重復性較好。

圖1 熒光定量PCR的動力學曲線Fig.1 Kinetics curve of FQ-PCR

圖2 熒光定量PCR的標準曲線Fig.2 Standard curve of FQ-PCR

表1 豬瘟病毒陽性樣品的重復性試驗Table 1 The reproducibility test of FQ-PCR for CSFV

2.7 臨床樣品的檢測

從隨機抽取的150份組織樣品進行熒光定量PCR檢測,結果顯示,熒光定量PCR檢測出陰性樣品29份,套式PCR檢測出27份。對比結果表明,熒光定量PCR檢測方法的敏感性與套式PCR相近。

3 討論

熒光定量PCR是在普通PCR的基礎上,利用熒光染料在激發(fā)光的作用下所釋放的熒光信號的變化,來動態(tài)反映PCR擴增產(chǎn)物量的變化,以系統(tǒng)中發(fā)射熒光的強度代表PCR擴增產(chǎn)生的產(chǎn)物數(shù)量。它不僅實現(xiàn)了對核酸模板的定量,而且具有靈敏度高、特異性強、定量PCR可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點[9-10]。在國內熒光定量PCR技術已用于病毒的定量檢測[11-13]。

本研究應用Taq Man實時熒光定量PCR技術建立了快速檢測CSFV的方法,本方法在40個循環(huán)內即可檢測到10拷貝/μ L的病毒RNA,與套式PCR的敏感性處于同一數(shù)量級,檢測的線性范圍為107～101拷貝/μ L。通過對其他豬源病毒進行檢測,在40個循環(huán)內無非特異性擴增信號,驗證了其特異性。

試驗證明該方法有很高的特異性、靈敏性和重復性,能在較廣的范圍內準確定量。與傳統(tǒng)PCR相比,由于實時熒光定量PCR采取全封閉式反應,因而能有效解決PCR產(chǎn)物氣溶膠的污染問題,又能解決常規(guī)PCR易產(chǎn)生假陽性、不能定量、操作復雜等問題,且自動化程度高,無需電泳。從核酸抽提到熒光定量PCR反應完畢需要時間短,可以在短時間內同時對大量樣品進行定量檢測。

綜上所述,本研究成功建立了CSFV實時熒光定量PCR檢測方法,實現(xiàn)了快速、敏感、特異的定量檢測病料中的CSFV,為豬瘟感染的臨床診斷提供了一個良好的方法。

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