洼地綿羊MHC-DRB1基因PCR-RFLP多態(tài)性分析

肖 娜,任艷玲,李 敏,董文艷,沈志強(qiáng)*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州256600;2.山東省洼地綿羊繁育技術(shù)研究推廣中心,山東濱州256600;3.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州256600)

主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)是由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因位點(diǎn)所組成的復(fù)合物。哺乳動(dòng)物主要的組織相容復(fù)合物包括兩個(gè)亞家族,即或Ⅰ型和Ⅱ型。MHC的表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞表面的糖蛋白,MHCⅠ是由α微球蛋白和β2微球蛋白兩條多態(tài)鏈組成;MHCⅡ分子是異源二聚體,是由α和β鏈組成,在抗原細(xì)胞表面表達(dá)[1]。MHCⅠ、Ⅱ結(jié)構(gòu)上很類似,但是它們的功能卻不盡相同。MHCⅠ主要作為一種內(nèi)源抗體來應(yīng)答細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞,而MHCⅡ分子主要與外來抗原相結(jié)合并將這些抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞,最終引起機(jī)體的免疫反應(yīng)[2]。

不同物種之間MHC連鎖群包含的基因座位種類以及核苷酸序列的同源性非常高,綿羊的MHC稱為OLA(ovine lymphocyte antigen),位于綿羊第20號(hào)染色體上。MHC抗原由多肽結(jié)合區(qū)、類免疫球蛋白區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成,其中的多肽結(jié)合區(qū)是決定其抗原遞呈功能的結(jié)構(gòu)域,由MHC基因的第2外顯子編碼。研究表明,雖然MHC抗原的種類很多,只有DR抗原和DQ抗原主要發(fā)揮作用[3]。因此,有關(guān)MHC的報(bào)道多集中于DR基因和DQ基因的第2外顯子。

隨著長期自然選擇和人工選擇,洼地綿羊形成了獨(dú)特的優(yōu)勢,如繁殖力高、抗逆性強(qiáng)。然而,由于近年來外來商業(yè)綿羊品種以及具有優(yōu)良性狀的遺傳育種綿羊的引入,純種洼地綿羊的數(shù)目也在逐漸減少。如果群體數(shù)目繼續(xù)減少,將導(dǎo)致一些在免疫過程中起重要作用的基因的遺傳變異丟失,從而使該群體抗疾病能力減弱,面臨滅絕的危險(xiǎn)[4]。本研究對洼地綿羊群體中MHC-DRB1基因位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了初步的研究,為未來研究MHC基因?qū)ξ⑸镆鸬木d羊疾病感染的影響奠定了基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 洼地綿羊樣品來自山東省洼地綿羊原種場,共82只,頸靜脈采血,ACD抗凝,全血基因組試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。(Code D9081),提取基因組DNA,置—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物合成及PCR-RFLP 引物合成參照文獻(xiàn)[6],引物序列如下:

根據(jù)文獻(xiàn)[6]的試驗(yàn)條件為基礎(chǔ)進(jìn)行套式PCR。反應(yīng)體系為:第一輪(20 μ L)10×buffer 2.0 μ L,MgCl2(25 mmol/L)1.2 μ L,dNTP(2 mmol/L)1.2 μ L,HL031(1 μ mol/L)2.0 μ L,OLA-ERB1(1μ mol/L)2.0μ L,Taq 3 μ L(1.5 U),最后加ddH2O至20 μ L。PCR反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃30 s,50℃30 s,72℃60 s 5個(gè)循環(huán);72℃10 min,4℃終止反應(yīng)。

第二輪(20 μ L):10×buffer 2.0 μ,MgC12(25 mmol/L)1.2 μ L,dNTP(2 mmol/L)1.2 μ L,OLA-XRBI(1 μ mol/L)4.0 μ L,OLA-ERB1(1 μ mol/L)4.0 μ L,Taq 3 μ L(1.5 U);最后加ddH2O至20 μ L。PCR反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃30 s,63℃30 s,72℃60 s 30個(gè)循環(huán);72℃10 min,4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀觀察結(jié)果。

通過RFLP分析來檢測多態(tài)性位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過SacⅠ、HaeⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,然后經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。

1.2.2 MHC-DRB1基因克隆與序列分析 選取不同基因型的檢測樣品,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化后,連接pGEM-T載體,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,挑選陽性克隆,提取質(zhì)粒DNA,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序。

1.2.3 等位基因測序及遺傳多樣性分析 測序后,在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Standard nucleotide-nucleotide Blast搜索。各序列經(jīng)過DNA Star 5.03軟件包中的Editseq、Seqman和Megalign軟件并結(jié)合排序分析,比較序列的同源性。序列間的核苷酸、氨基酸差異數(shù)、轉(zhuǎn)換、顛換、各序列的堿基含量均由MEGA 3.0軟件進(jìn)行計(jì)算。分析該物種的遺傳多樣性?；蝾l率、基因型頻率、χ2適合性檢驗(yàn)以及基因雜合度的計(jì)算均用Popgene32軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 MHC-DRB1基因PCR擴(kuò)增

應(yīng)用套式PCR擴(kuò)增了洼地綿羊MHC-DRB1的第2外顯子,擴(kuò)增產(chǎn)物為296 bp(圖1)。

2.2 PCR-RFLP結(jié)果

參照Konnai S等[6]報(bào)道的綿羊酶切圖譜和等位基因命名方法對綿羊MHC-DRB1基因PCRRFLP的電泳檢測結(jié)果進(jìn)行判型。

在SacⅠ酶切位點(diǎn)上,洼地綿羊表現(xiàn)出多態(tài)性,出現(xiàn)有(296 bp)、BB(208 bp和88 bp)和AB(296、208、88 bp)3種表型,SacⅠ酶切位點(diǎn)受A和B兩個(gè)共顯性基因控制(圖2)。82個(gè)洼地綿羊個(gè)體MHC-DRB1經(jīng)SacⅠ酶切后的基因頻率和基因型頻率見表1。

在HaeⅢ酶切位點(diǎn)上,82個(gè)洼地綿羊個(gè)體上出現(xiàn)了12種基因型,即AA、CC、DD、BB、EE、BC、BE、DE、CD、AD、AE、AC,有5種復(fù)等位基因,即A(159 bp/137 bp)、B(159 bp/123 bp/14 bp)、C(159 bp/71 bp/52 bp/14 bp)、D(225 bp/71 bp)、E(159 bp/66 bp/71 bp)控制(圖3)。5種等位基因中A、B、C、E與Konnai S等[6]報(bào)道的綿羊酶切圖譜中6種等位基因中的4種相同,分別是等位基因c(159/137)、d(159 bp/123bp/14 bp)、e(159 bp/66 bp/71 bp)、f(159 bp/71 bp/52 bp/14 bp)。同時(shí)確定了12個(gè)基因型,5個(gè)純合型和7個(gè)雜合型。82個(gè)洼地綿羊個(gè)體MHC-DRB1經(jīng)HaeⅢ酶切后的基因頻率和基因型頻率見表1。此外,本研究發(fā)現(xiàn)的5種等位基因中,D等位基因是一種新的等位基因,在以前的研究中并未發(fā)現(xiàn)[7-9]。

圖1 套式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果Fig.1 Detecting results of nested PCR products

圖3 DRB1基因的HaeⅢ酶切鑒定Fig.3 Identificationn of DRB1 gene digested with HaeⅢ

表1 洼地綿羊M HC-DRB1外顯子2SacⅠ、HaeⅢ酶切位點(diǎn)的基因型和等位基因及其頻率Table1 Genotypes and alleles frequencies at the loci digested withHaeⅢandSacⅠof MHC-DRB1 gene exon 2 in Wadi sheep

2.3 χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果

采用χ2適合性檢驗(yàn)法分析了洼地綿羊MHCDRB1基因外顯子2是否處于平衡狀態(tài)。適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明,洼地綿羊在限制性內(nèi)切酶SacⅠ、HaeⅢ的χ2值分別是4.608(P＜0.05)、41.286(P＜0.01),均未達(dá)到Hardy-Weiberg平衡狀態(tài)。

2.4 HaeⅢ酶切目的DNA的測序及序列分析結(jié)果

目的DNA測序及序列分析得到5個(gè)等位基因(圖4)。在82只洼地綿羊MHC-DRB1 exon 2序列長度為296 bp中,共發(fā)現(xiàn)41(14%)個(gè)變異位點(diǎn),不包括同一位點(diǎn)出現(xiàn)多種堿基的位點(diǎn),未發(fā)現(xiàn)插入或缺失位點(diǎn)。4種堿基的含量分別為A 22.2%,C 24.4%,G 34.6%,T 18.9%,其中(G+C)為59%,高于(A+T)41.1%。

本研究所獲得目的序列編碼98個(gè)氨基酸(圖5),其中69個(gè)位點(diǎn)為保守區(qū),29個(gè)位點(diǎn)為可變區(qū)。20種氨基酸中沒有酪氨酸,其他19中氨基酸雖然有使用,但是使用頻率差異很大,如絲氨酸使用頻率高達(dá)19.836,而天冬酰胺的使用頻率僅為0.204 5%。丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸的含量分別是7.98%、3.48%、2.05%、2.66%、1.02%、11.24%、1.02%、3.48%、1.43%、3.68%、1.63%、0.20%、5.93%、1.02%、10.63%、19.83%、14.31%、2.86%、5.52%。

利用最大簡約法[10],非同義替換率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同義替換率(dn∶ds=5∶1)。

圖4 洼地綿羊M HC-DRB1外顯子2等位基因核苷酸序列比對結(jié)果Fig.4 An alignment of nucleotide sequences among the alleles of MHC-DRB1 exon 2 of Wadi sheep populations.

圖5 洼地綿羊M HC-DRB1外顯子2等位基因氨基酸序列比對結(jié)果Fig.5 An alignment of nucleotide sequences among the alleles of MHC-DRB1 exon 2 of Wadi sheep

3 討論

通過RFLP-PCR技術(shù)及序列測序分析了DRB1基因外顯子2存在高度多態(tài)性。序列測序發(fā)現(xiàn)了多種等位基因,等位基因序列比對分析存在豐富的堿基以及氨基酸替代[11]?；蜃簧匣虻亩鄳B(tài)性使得基因產(chǎn)物的多樣性增加,從而使機(jī)體能夠在內(nèi)或外界抗原引起的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用,這一現(xiàn)象在Nino-Vasquez J J等[12]的研究中也有報(bào)道。洼地綿羊MHC-DRB1基因外顯子2等位基因及基因型χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果說明,在SacⅠ和HaeⅢ的酶切位點(diǎn)未達(dá)到HardyWeinbery(P＜0.05)平衡狀態(tài)。酶切位點(diǎn)的非平衡狀態(tài)可能是由于基礎(chǔ)群體的選擇以及研究所選擇的綿羊群體中個(gè)體數(shù)目較少的原因。也可能是由于長期進(jìn)化過程中一些控制重要生產(chǎn)性狀的基因發(fā)生了遺傳漂移或遺傳選擇的原因。

在本研究的洼地綿羊群體中發(fā)現(xiàn)的一種新的等位基因DRB1.D與薩?？搜蛉?、多浪羊[13]群體中的DRB1基因的等位基因不同。本文提供了一種新抗病的等位基因,該種群特異性的等位基因可能是由于自然選擇的結(jié)果。但是,MHC-DRB1等位基因與綿羊抗某種疾病的相關(guān)性還需要進(jìn)一步研究。而本文洼地綿羊群體MHC-DRB1基因中另外4種等位基因與薩福克羊群[2]、多浪羊[13]群體中的DRB1基因的等位基因是相同的,然而基因型卻不盡相同,這可能是由于綿羊群體生存的微環(huán)境相同或類似,如氣候、生態(tài)環(huán)境、地理環(huán)境等因素,而這些因素可能都會(huì)對其產(chǎn)生影響。

一般認(rèn)為,自然選擇主要在蛋白質(zhì)水平上起作用,同義突變不造成氨基酸順序的任何變化,因而,同義突變被當(dāng)作選擇上呈中性突變的侯選者。本研究計(jì)算了dn/ds,遠(yuǎn)高于1。這說明非同義位點(diǎn)的進(jìn)化速度要高于同義位點(diǎn),這一特點(diǎn)也可能使得新的基因變異產(chǎn)生和多態(tài)性增加,也為MHC基因適應(yīng)同樣不斷變化的抗原創(chuàng)造了條件[14]。

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