鵝源H9N2亞型禽流感病毒PB2和PB1基因序列分析*

付 薇,覃芳蕓,馬 琳,徐賢坤,黃勝斌,易春華,孫翔翔,何奇松,蔣家霞,熊 毅*

(1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西南寧530001;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005)

禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一種禽類(lèi)急性和高度接觸性傳染病。根據(jù)病毒表面糖蛋白凝血素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同,可將A型流感病毒分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型[1],其中H9N2亞型屬于低致病性禽流感病毒,其流行廣泛,感染后家禽以出現(xiàn)呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率和孵化率下降為主要特征,此外該病毒可以引起免疫抑制而易出現(xiàn)繼發(fā)感染[2]。該型禽流感病毒自1966年被分離到以來(lái),目前已經(jīng)普遍存在于各國(guó)禽群中;1999年中國(guó)香港及廣東省發(fā)生了H9N2亞型禽流感病毒感染人的病例,先后從禽、豬、人體內(nèi)均分離到該型病毒[3-4],迫使人類(lèi)重新認(rèn)識(shí)到禽流感的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

AIV基因組由8條不連續(xù)的單股負(fù)鏈RNA節(jié)段組成,總長(zhǎng)度約為13.6 kb,至少編碼10種蛋白質(zhì)[5]。節(jié)段1和節(jié)段2最長(zhǎng),均為2.3 kb,各有一個(gè)開(kāi)放式閱讀框架(ORF),分別編碼寡聚酶蛋白PB2(759 aa)和PB1(757 aa)[6]。這兩種寡聚酶蛋白均是RNA轉(zhuǎn)錄酶的重要成分,具有識(shí)別和結(jié)合來(lái)源于宿主細(xì)胞的帽子結(jié)構(gòu),啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄等功能,對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞及病毒的基因表達(dá)與復(fù)制是必需的[7]。本研究對(duì)從廣西北海市合浦縣分離到的一株鵝源H9N2亞型AIV的PB1和PB2基因病毒進(jìn)行遺傳分析,從分子生物學(xué)的角度了解該病毒在不同地區(qū)、不同宿主的遺傳變異情況,為H9N2亞型禽流感的防控提供一定科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 鵝源H9N2亞型禽流感病毒A/Goose/Guangxi/01/07(簡(jiǎn)稱A/GS/GX/01/07)由廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心分離保存。1.1.2 主要試劑 T rizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司,Rnase Inhibitor、M-M LV反轉(zhuǎn)錄酶、EX-Taq、Gel Extraction Mini Kit膠回收試劑盒、DNA Marker DL 2 000、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展公司。

1.1.3 引物合成 參照國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的AIV H9N2的PB1、PB2基因序列,應(yīng)用Oligo6.0設(shè)計(jì)引物。PB1F:5′-AGCRAAAGCAGGCAAACCATT-3′,PB1R:5′-CCGAGTAGAAACAAGGCATTTTTTCA-3′,擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度約為2 300 bp;PB2F:5′-CCAGCRAAAGCAGGTCAAATATAT TCA-3′,PB2R:5′-TTAGTAGAAACAAGGTCGT TT T TAAACTA-3′,擴(kuò)增目的片段約為2 300 bp。

反轉(zhuǎn)錄引物為通用引物Uni12:5′-AGCRAAAGCAGG-3′。上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒總RNA的提取 用T rizol方法從接種病毒的SPF雞胚尿囊液中提取RNA,提取的RNA立即用于RT-PCR或于—20℃凍存?zhèn)溆?。?yáng)性對(duì)照為廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心家畜科實(shí)驗(yàn)室保存的H9N2禽流感亞型陽(yáng)性雞胚尿囊液,陰性對(duì)照為DEPC處理水。

1.2.2 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μ L:5×-M-MLV buffer 5 μ L,HIR,0.5 μ L,抑制劑MMLV,0.5 μ L,dNTPs(10 mmol/L)2 μ L,RNA 2 μ L。反應(yīng)條件為:42℃1 h,95℃5 min。

PCR體系為25 μ L:10×E×Taq buffer 2.5 μ L,dNTPs2.5mmol/L2 μ L,MgCl2(25 mmoL/L)1.0 μ L,Taq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.3 μ L,上下游引物(25 pmoL/μ L)分別加入0.5 μ L,加入12.5 μ L ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件為:95℃5 min;95℃1 min,53℃1 min,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃10 min,4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.3 目的基因的回收、克隆及序列分析 PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,可見(jiàn)到約為含2.3 kb的目的片段。按膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)目的DNA進(jìn)行回收。將純化回收的PB1、PB2的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,對(duì)酶切和PCR鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序;應(yīng)用DNA Star軟件與已知的H9N2毒株的PB2、PB1基因進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)氨基酸比較,繪制進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,可見(jiàn)片段大小均約為2.3 kb的PB2和PB1特異性目的條帶(圖1和圖2),大小與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PB2基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of PB2 gene

圖2 PB1基因PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR products of PB1 gene

2.2 基因序列分析

2.2.1 PB2基因的同源性分析 測(cè)序結(jié)果表明,分離株鵝源H9N2 AIV的PB2基因?yàn)? 341 bp,完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)由2 280個(gè)核苷酸組成,分別編碼759個(gè)氨基酸,分離的鵝源H9N2病毒在關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)第627位氨基酸為Glu,第701位氨基酸位Asp。將分離株與15個(gè)參考毒株的基因PB2基因進(jìn)行同源性比較,其參考毒株CK/GX/14/00,GS/MN/57331/80、pfGS/Netherlands/1/06、Quail/HK/G1/97的核苷酸同源性較高,分別為98.2%、97.1%、97.1%和97.3%,推導(dǎo)氨基酸序列同源性為98.2%、97.1%、97.1%和97.3%。

2.2.2 PB1基因的同源性分析 測(cè)序結(jié)果表明,廣西鵝源H9N2 AIV分離株的PB1基因?yàn)? 341 bp,完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)分別由2 277個(gè)核苷酸組成,編碼758個(gè)氨基酸,分離的鵝源H9N2病毒在關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)第13位的推導(dǎo)氨基酸為Pro,678位氨基酸處為Ser。將分離株與16個(gè)參考毒株的PB1進(jìn)行同源性比較,其參考毒株Bd/GX/82/05、CK/GX/14/00和Quail/HK/G1/97的核苷酸同源性較高,分別達(dá)到95.8%、94.0%和93.8%,推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為98.4%、97.2%和97.0%。

2.2.3 PB2、PB1基因的遺傳進(jìn)化分析 H9N2 AIV的遺傳演化分為歐亞種系和北美種系,其中歐亞種系又分為3個(gè)群系,即DK/HKY280/97(第1亞群),QA/HK/G1/97(第2亞群)和DK/HK/Y439/97(第3亞群)。分離株P(guān)B2、PB1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,此株鵝源分離株與歐亞種系的第2亞群QA/HK/G1/97代表株的親緣關(guān)系較近,屬于歐亞種系第2亞群;與廣西的雞源CK/GX/14/00,鳥(niǎo)源Bd/GX/82/05的親緣關(guān)系也較近(圖3和圖4)。

圖3 PB2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of PB2 gene

圖4 PB1基因遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of PB1 gene

3 討論

禽流感病毒在自然界的分布范圍很廣,除在家禽(雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥(niǎo)、鵪鶉等)能分離到病毒外,在野禽、海鳥(niǎo)等鳥(niǎo)類(lèi)亦分離到病毒,野鳥(niǎo)是AIV的自然宿主[8]。水禽是AIV最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),水禽與豬在AIV的遺傳衍化及傳播中發(fā)揮著重要作用[9]。而廣西地處于亞熱帶的華南地區(qū),氣候潮濕溫暖,水網(wǎng)密布,農(nóng)村家養(yǎng)陸禽、水禽與豬混養(yǎng)的飼養(yǎng)方式普遍存在,增大了AIV在各種宿主之間的流行傳播的風(fēng)險(xiǎn)。本研究采樣鵝場(chǎng)附近廣泛分布著農(nóng)村散養(yǎng)戶以及各中小型豬場(chǎng),并從健康鵝分離到H9N2 AIV,開(kāi)展了鵝源H9N2病毒各基因片段的測(cè)序及分析研究,初步了解廣西鵝源禽流感的遺傳演化關(guān)系,為加緊對(duì)廣西地區(qū)禽流感病毒帶毒監(jiān)控與研究,對(duì)禽流感防控提供相關(guān)科學(xué)理論依據(jù)。

流行于世界各國(guó)禽群中的H9N2亞型禽流感病毒基本可分為北美及歐亞兩種譜系。Li C J等[10]認(rèn)為中國(guó)南方陸棲禽類(lèi)中主要流行歐亞譜系中的兩種亞系的H9N2亞型AIV,其中以CK/BJ/1/94或者DK/H K/Y280/97為代表的亞系主要流行于雞群,另一亞系主要流行于鵪鶉,代表毒株為Qa/HK/G1/97。Guan Y等[11-12]對(duì)1996年—2002年分離的27株H9N2亞型AIV毒株的研究表明流行于中國(guó)內(nèi)陸的H9N2亞型AIV源于CK/BJ/1/94。而本研究所分離到的鵝源H9N2 AIV與鵪鶉株Qa/HK/G1/97親緣關(guān)系較近,與另一亞系代表株DK/H K/Y280/97親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。動(dòng)物試驗(yàn)證明,鵪鶉更容易感染H9N2 AIV,而且可能是從禽類(lèi)傳染給人或哺乳動(dòng)物的中間宿主[13],可以跨過(guò)種間屏障感染人類(lèi),對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。本研究分離到的鵝源H9N2 AIV與廣西一株鳥(niǎo)源H9N2 AIV同屬于以鵪鶉源毒株為代表的第2亞群中,說(shuō)明該亞群的H9N2病毒在廣西的鵝或水禽中存在,對(duì)廣西H9N2的發(fā)生與流行具有潛在的威脅。

Ohtsu Y等[14]研究發(fā)現(xiàn),PB1蛋白與PA蛋白結(jié)合位點(diǎn)(1～25位殘基)處的第13位氨基酸為Pro,與PB2蛋白結(jié)合位點(diǎn)(600～757殘基)處的第678位氨基酸為Asn時(shí),能夠促進(jìn)聚合酶亞單位與NP蛋白在新宿主環(huán)境中的相互作用,通過(guò)對(duì)聚合酶活性的調(diào)控來(lái)影響流感病毒對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物的致病性。本研究分離株在13位的推導(dǎo)氨基酸為Pro,678位氨基酸處為Ser,有部分符合能夠影響病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病性的分子基礎(chǔ),但這種特征具體會(huì)對(duì)流感病毒的跨種間傳播以及致病性產(chǎn)生怎樣的影響目前還難以做出判斷,需要進(jìn)一步深入研究。

Hatta M等[15]認(rèn)為,AIV PB2蛋白第627位氨基酸由Glu變成Lys能增強(qiáng)毒株對(duì)小鼠和人的致病性。李澤君等[16]研究發(fā)現(xiàn),PB2蛋白第701位氨基酸由天冬氨酸(Asp)變?yōu)樘於０?Asn)的毒株能提高毒株對(duì)小鼠的致病性。管軼等[17]認(rèn)為PB2蛋白第714位氨基酸由Ser變?yōu)镮le或Gly時(shí),病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病能力增強(qiáng)。本研究分離的鵝源H9N2病毒在第627位氨基酸為Glu,第701位氨基酸位Asp,表明其不具備對(duì)小鼠高致病性的禽流感病毒特征;而其第714位氨基酸為Ser,同樣說(shuō)明本毒株的低致病性特征。但在自然感染途徑下,PB1、PB2某些氨基酸位點(diǎn)的突變可以減少對(duì)宿主的致病力[18]。因此,需要對(duì)AIV感染的分子基礎(chǔ)及感染的分子機(jī)理進(jìn)行更深入的研究。

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