O型口蹄疫病毒VP1基因的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立*

王云龍,孫 強(qiáng),昌靜峰,李玉林,王國(guó)強(qiáng),董彩文,劉旺根,梁曉艷,孫新城

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453007;2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州450121;3.河南省生物工程技術(shù)研究中心,河南鄭州450001)

近年來(lái),許多動(dòng)物傳染病的暴發(fā)給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大沖擊,其中口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)因其發(fā)生的廣泛性和嚴(yán)重破壞性而被人們高度關(guān)注。根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office international des epizooties,OIE)規(guī)定,一旦暴發(fā)FMD,所有感染和接觸的動(dòng)物都必需宰殺并銷毀尸體。目前,除大洋洲和北美洲,FMDV已侵襲過(guò)所有大陸[1]。FMD的病原為口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)。該病毒為小RNA病毒,病毒粒子包括衣殼和RNA兩部分。衣殼(VP)由VP1、VP2、VP3、VP4四類蛋白組成,它們又各由60個(gè)分子組成[2]?，F(xiàn)已證明,對(duì)于O型口蹄疫,有3個(gè)中和性抗原位點(diǎn)在VP1上,位于21～40、141～160、200～213位氨基酸,其中141位～160位及200位～213位氨基酸為B細(xì)胞表位,引發(fā)體液免疫反應(yīng)[3]。從病毒衣殼蛋白分離的VP1可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)該表位的中和性抗體[4]。因此,人們已經(jīng)開(kāi)始嘗試?yán)靡職さ鞍咨系目乖砦辉O(shè)計(jì)重組基因工程抗原以檢測(cè)和預(yù)防FMD[5]。

基于VP1基因?qū)MDV的重要意義,本研究以河南省生物工程技術(shù)研究中心提供的質(zhì)粒T234/FMDV為模板,擴(kuò)增出結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因,應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-41b,以重組蛋白的形式對(duì)VP1基因進(jìn)行表達(dá),并對(duì)表達(dá)的重組蛋白抗原性進(jìn)行了檢測(cè),為進(jìn)一步研制FMDV VP1診斷試劑盒和基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及引物

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、抗體和血清 克隆菌TG1、表達(dá)菌BL21(DE3),質(zhì)粒T234/FMDV,表達(dá)載體pET-41b,HRP標(biāo)記的兔抗豬抗體,豬FMDV陽(yáng)性血清,豬FMDV陰性血清,豬圓環(huán)病毒(Porcine circo virus,PCV)陽(yáng)性血清,豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)陽(yáng)性血清,豬細(xì)小病毒(Porcine parvoviurs,PPV)陽(yáng)性血清,由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶,Taq DNA聚合酶,T4DNA連接酶,無(wú)DNA酶的胰RNA酶,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pfu DNA聚合酶,天為時(shí)代公司產(chǎn)品;DNA回收試劑盒,QIA Gen-Sciences公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 引物由上海博尚生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增 以攜帶有VP1基因的T234/FMDV為模板,擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃50 s,58℃50 s,72℃50 s,30個(gè)循環(huán);72℃5 min。按照DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)(QIA Gen Sciences)回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、HindⅢ分別酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-41b。按DNA膠回收試劑盒說(shuō)明操作回收PCR產(chǎn)物和線性化載體片段,T4連接酶16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TG1中,涂布LB平板(卡那霉素30 mg/L),37℃過(guò)夜培養(yǎng)。篩選陽(yáng)性菌落,搖菌,堿裂減法提取質(zhì)粒,BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中,LB平板(卡那霉素30 mg/L)篩選陽(yáng)性菌株,寄送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。菌種按1∶1的比例加入到滅菌的150 mL/L的甘油中,置—80℃保存。

1.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組菌在37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.7時(shí),加IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,37℃誘導(dǎo)5 h。誘導(dǎo)結(jié)束后取出,冰浴10 min,收集菌體,0.02 mol/L pH 7.8 PBS洗滌,pH 7.8 PBS重懸,超聲破碎后,12 000 r/min離心2 min,收集上清和沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE分析。用BL21(DE3)空菌作為陰性對(duì)照。

1.2.4 Western blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物免疫活性 按照Sambrook方法進(jìn)行Western blot[6]。一抗使用豬抗FMDV陽(yáng)性血清,二抗使用H RP標(biāo)記的兔抗豬抗體,鑒定活性。

1.2.5 目的蛋白的純化及復(fù)性 取重組菌株大量發(fā)酵,誘導(dǎo)條件同1.2.3。5 000 r/m離心10 min,棄上清,10mL/LTritonX-100洗滌沉淀。5 000 r/m離心10 min,棄上清,0.02 mol/L pH 7.8 PBS重懸,8 mol/L尿素溶解,過(guò)鎳親和層析柱,依次用含20、50、100、200 mmol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫,SDS-PAGE電泳檢測(cè)洗脫液,凝膠薄層掃描軟件分析蛋白純度。純度較高的蛋白質(zhì)溶液按文獻(xiàn)[7]的方法復(fù)性。

1.2.6 間接ELISA檢測(cè)方法的建立 用方陣滴定法,以不同濃度的表達(dá)蛋白作為包被抗原,4℃包被過(guò)夜,洗滌后用10 g/L BSA在37℃封閉2 h。用樣品稀釋液1∶10開(kāi)始倍比稀釋豬O型口蹄疫陽(yáng)性血清,豬O型口蹄疫陰性血清1∶10稀釋作為陰性對(duì)照,按ELISA步驟進(jìn)行操作,以陽(yáng)性血清的OD450值接近1,P/N值最大時(shí)的抗原濃度為最佳包被抗原濃度,對(duì)應(yīng)的血清稀釋倍數(shù)為最佳血清稀釋度[8]。

1.2.7 酶結(jié)合物最佳稀釋度 HRP標(biāo)記的兔抗豬抗體按1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶12 000的比例稀釋,每個(gè)稀釋度加2孔,以陽(yáng)性血清的OD450值接近l,P/N值最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為酶結(jié)合物最佳工作濃度。

1.2.8 間接ELISA陰性陽(yáng)性臨界值判定 取20份O型口蹄疫陰性血清,80倍稀釋作為待檢血清,測(cè)OD450值后計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,以X_±2S為陰性、陽(yáng)性血清的臨界值,OD450值大于此臨界值的為陽(yáng)性。

1.2.9 間接ELISA的特異性的檢測(cè) 分別檢測(cè)FMDV陽(yáng)性血清、FMDV陰性血清、PCV陽(yáng)性血清、CSFV陽(yáng)性血清、PPV陽(yáng)性血清,鑒定ELISA檢測(cè)方法的特異性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,可見(jiàn)一條約640 bp左右的條帶,與預(yù)期相符(圖1)。

圖1 VP1基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR Amplication of VP1 gene

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

提取質(zhì)粒后酶切鑒定,結(jié)果顯示切出的片段大小與預(yù)期相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果與GenBank(登錄號(hào):GQ292738.2)上公布的序列進(jìn)行比對(duì),同源性達(dá)98%。

圖2 重組質(zhì)粒pET-41b/VP1酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-41b/VP1 by enzy me digestion

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

BL21(DE3)/pET-41b/VP1在37℃,0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下以包涵體形式表達(dá),SDS-PAGE顯示目的蛋白分子質(zhì)量在58 ku左右(圖3)。

圖3 SDS-PAGE分析BL21(DE3)/pET-41b/VP1的表達(dá)Fig.3 Expression of BL21(DE3)/pET-41b/VP1 analyzed by SDSPAGE

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳、Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示沉淀液處出現(xiàn)1條特異性條帶(圖4),說(shuō)明所表達(dá)的重組蛋白能被口蹄疫陽(yáng)性血清所識(shí)別,表明純化的重組蛋白具有與相應(yīng)天然蛋白相同的抗原性。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.4 Analysis of the ex pressed fusion protein by Western blot

2.5 表達(dá)產(chǎn)物純化及SDS-PAGE電泳分析

采用鎳親和層析柱對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化。從SDS-PAGE電泳結(jié)果可以清晰地看出在分子質(zhì)量約58 ku處有明顯的目的蛋白條帶。經(jīng)過(guò)50 mmol/L咪唑洗脫收集的蛋白經(jīng)薄層層析掃描,其純度可達(dá)97.7%,但濃度較低(圖5)。

圖5 SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果Fig.5 Purification of VP1 analyzed by SDS-PAGE

2.6 間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立

隨著VP1蛋白抗原包被量的減少和血清稀釋倍數(shù)的增大,測(cè)得的OD值不斷減小;當(dāng)VP1蛋白抗原包被量為1 mg/L,血清稀釋倍數(shù)為80倍時(shí),FMDV陽(yáng)性血清的OD450值在1.0左右,P/N值達(dá)到20.71(陰性對(duì)照值為0.048)。因此,ELISA方陣確定的最佳抗原包被量為1 mg/L,血清稀釋倍數(shù)為80倍。

2.7 酶結(jié)合物的最佳稀釋度

酶結(jié)合物的稀釋度為1∶8 000時(shí),OD值接近1,P/N值最大,將其定為酶結(jié)合物的最佳稀釋度(表1)。

2.8 間接ELISA檢測(cè)臨界值判定

20份口蹄疫陰性血清,80倍稀釋后作為待檢血清,測(cè)OD450值后計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,_X±2S值為0.042,S值為0.011,則臨界值_X±2S為0.064(表2)。

2.9 間接ELISA的特異性的檢測(cè)

豬抗FMDV陽(yáng)性血清檢測(cè)為陽(yáng)性,其余的樣品檢測(cè)為陰性(表3)。

表1 方陣試驗(yàn)確定抗原包被濃度和抗體工作稀釋度T able 1 Selection of ideal antigen coating concentration and antiserum dilution

表2 酶結(jié)合物最佳稀釋度的篩選T able 2 Screening of optimal dilution of peroxidase

表3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of specificity test

3 討論

目前,針對(duì)FMDV的檢測(cè)方法主要是間接血凝和全病毒的ELISA方法,然而這兩種方法都是建立在全病毒的基礎(chǔ)上的,存在著一定的安全隱患[9-10]。由于經(jīng)過(guò)純化、復(fù)性的VPl蛋白與其抗血清結(jié)合能力強(qiáng),因此可將經(jīng)過(guò)純化、復(fù)性的VPl蛋白作為包被抗原,開(kāi)發(fā)口蹄疫病毒VPl結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA診斷試劑盒,檢測(cè)易感動(dòng)物抗體水平[11]。ELISA的非特異性是許多研究者都遇到過(guò)的共同的問(wèn)題,影響的因素也較多。采用高純度的抗原抗體是降低非特異性反應(yīng)的關(guān)鍵性因素。利用基因工程克隆和表達(dá)FMDV VP1編碼基因的報(bào)道很多,有的用大腸埃希菌、酵母、桿狀病毒或痘病毒表達(dá),也有的用哺乳動(dòng)物細(xì)胞甚至植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)FMDV部分結(jié)構(gòu)蛋白、全部結(jié)構(gòu)蛋白和空衣殼[12],但在這些方法中提高表達(dá)量或進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的純化是難點(diǎn)。本試驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)了VP1重組蛋白,結(jié)果表明VP1在E.coli中得到了高效表達(dá),經(jīng)37℃,0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)蛋白為包涵體,變性、純化和復(fù)性處理后,目的蛋白的純度可達(dá)90%以上。由于只有當(dāng)包被的抗原同感染動(dòng)物的FMDV中的相應(yīng)抗原在結(jié)構(gòu)上完全一致時(shí),才會(huì)有抗原抗體結(jié)合反應(yīng)發(fā)生[13],故Western blot檢測(cè)結(jié)果肯定了我們所純化的重組蛋白具有抗原性。

綜上所述,利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)了VP1重組蛋白,通過(guò)鎳親和層析法對(duì)這一蛋白進(jìn)行了純化。收獲的目的蛋白純度高、活性良好。本研究對(duì)間接ELISA條件的摸索和O型口蹄疫診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

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