實時熒光RT-PCR鑒別檢測美洲型PRRSV及其變異株*

羅寶正,王連想,薄清如,王愛民,徐海聶,黃好興

(1.珠海出入境檢驗檢疫局國家外來病檢測重點實驗室,廣東珠海519015;2.廣東溫氏食品集團有限公司,廣東新興527300;3.珠海市農(nóng)業(yè)局,廣東珠海519000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱“豬藍耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的高度傳染性免疫抑制疾病,以成年豬早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎,以及仔豬呼吸異常為特征,常常繼發(fā)其他病原感染[1]。自1987年美國報道以來,該病已逐漸成為困擾世界各國養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病,給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了重大經(jīng)濟損失,也是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中豬病控制的重點和難點[2]。我國1996年首次報道PRRS,關于該病發(fā)生、流行以及研究的報告日趨增多[3-5]。PRRSV分為美洲型和歐洲型,截止目前我國尚未發(fā)現(xiàn)由歐洲型毒株感染引起的豬藍耳病。2006年5月份以來,在我國多個省份暴發(fā)流行并造成仔豬大量死亡的豬“高熱病”疫情,經(jīng)過流行病學調(diào)查、病原分離鑒定、動物試驗等科技攻關,證實了其病原為美洲型PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)[6]。目前,該變異毒株已廣泛存在于我國多個省份。

傳統(tǒng)的PRRS診斷方法有病毒分離、ELISA、免疫過氧化酶單層試驗、間接熒光試驗、血清中和試驗等,然而傳統(tǒng)診斷方法無法區(qū)分PRRSV和PRRSV變異株,因而急需研究出快速、靈敏、便捷的實驗室診斷方法。熒光RT-PCR作為一種新型核酸檢測技術比普通RT-PCR具有更多優(yōu)勢。本研究擬建立美洲型PRRSV通用實時熒光RT-PCR及其變異株(NSP2 1594～1680缺失)實時熒光RT-PCR檢測方法,期望為科學監(jiān)測和綜合防控PRRS提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 美洲型PRRSV Ch-1a株為PRRSV弱毒疫苗株,上海海利生物藥品有限公司;ATCC VR-2332株為PRRSV弱毒疫苗株,勃林格殷格翰動物保健(美國)有限公司。

美洲型PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失):GDBY-3株為第3代細胞分離變異株(NSP2 1594～1680缺失),廣東省動物防疫監(jiān)督總所分離鑒定保存;JX-A1株為PRRSV滅活疫苗株,廣東省肇慶大華農(nóng)生物技術有限公司。

豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型均為細胞毒,由珠海出入境檢驗檢疫局保存。

1.2 方法

1.2.1 TCID50測定 GDBY-3株為第3代細胞分離株,其TCID50測定按Reed Muench法進行。

1.2.2 RNA的提取 病毒、樣品總RNA提取用Mrcgene公司的T rizol Reagent Kit,按其說明書進行。用20 μ L DEPC H2O溶解提取的RNA。取2 μ L用于RT-PCR反應。

1.2.3 引物、探針的設計與合成 從GenBank中獲取多個美洲型PRRSV M基因序列和病毒變異株(NSP2 1594～1680缺失株)NSP2區(qū)域基因序列,用CLUSTAL X進行序列分析,找到保守片段用Primer Express 2.0進行特異性引物、探針設計。引物和探針均在上海英駿生物技術有限公司合成。探針5′端標記發(fā)光基團FAM,3′端標記泯滅基團TAMRA。PRRSV特異性引物和探針:上游引物5′-GAT TGCGGCAAATGATAACCA-3′;下游引物5′-AACCCGGGCACCAATGT-3′;Taqman探針FAM-ATT TGTCGTCCGGCGTCCCG-TAMRA。PRRSV變異株引物和探針:上游引物5′-CAGGATGAGCCTCTGGATT TG-3′;下游引物5′-CCTCCAGGATGCCCAT GTT-3′;Taqman探針FAM-CGGAATATGAGGCT TTCCCCCTAGCATAMRA。其中,針對M基因的引物、探針用于建立美洲型PRRSV通用實時熒光RT-PCR檢測方法,針對NSP2基因的引物探針用于建立PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失株)實時熒光RTPCR檢測方法。

1.2.4 RT-PCR產(chǎn)物的克隆、測序 使用TAKARA公司一步法RT-PCR試劑盒進行擴增,每條引物終濃度為0.2 mmol/L。反應條件為50℃逆轉錄30 min;94℃預變性2 min;然后94℃10 s,58℃30 s,72℃30 s,40個循環(huán);最后72℃7 min延伸。取RT-PCR產(chǎn)物5 μ L在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存結果。將擴增到的目的基因片段采用T-A克隆方案克隆至pMD18-T載體。使用QIAGEN公司的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒抽提重組質(zhì)粒(按照說明書進行),送廣州英駿生物公司測序。

1.2.5 實時熒光RT-PCR檢測 對兩套引物、探針配制的反應體系進行實時熒光RT-PCR,反應條件均為42℃30 min;92℃2 min;然后92℃10 s,55℃30 s,40個循環(huán);反應在Lightcycler實時熒光PCR儀上進行。每條引物終濃度為0.4 mmol/L,探針濃度為0.2 mmol/L。反應體系使用深圳匹基公司的顆粒酶和珠?？频巧锛夹g有限公司的TaqDNA聚合酶配制,每個反應使用1/4顆粒酶和2 U TaqDNA聚合酶。加入DEPC H2O將每個反應體系補足到25 μ L。

1.2.6 特異性檢測 提取PRRSV弱毒疫苗株(Ch-1a株、ATCC VR-2332株)和變異PRRSV毒株(GDBY-3株、JX-A1株)、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本腦炎病毒等病毒RNA,提取豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA,用上述實時熒光RT-PCR進行檢測,驗證其特異性。

1.2.7 敏感性檢測 對GDBY-3分離株進行10倍倍比稀釋,每個稀釋度200 μ L提取病毒RNA為模板,配制反應體系在實時熒光PCR儀上檢測進行敏感性試驗,檢測到的最低濃度作為該方法的靈敏度。

1.2.8 臨床可疑樣品檢測 建立的兩種實時熒光RT-PCR檢測方法對24份臨床可疑樣品進行檢測,包括豬肺、淋巴結、組織樣品和血液。同時用病毒分離方法進行檢測。

2 結果

2.1 RT-PCR反應及克隆測序

根據(jù)引物的設定,PRRSV RT-PCR產(chǎn)物預期大小為81 bp,PRRSV變異株RT-PCR產(chǎn)物91 bp。RT-PCR產(chǎn)物測序結果在GenBank中進行比對,與目的片段序列基本一致。

2.2 實時熒光RT-PCR反應的建立

2.2.1 特異性試驗 利用設計的兩套引物、探針配制反應體系,提取PRRSV弱毒疫苗株(Ch-1a株、ATCC VR-2332株)和PRRSV變異株(GDBY-3株、JXA1株)RNA進行檢測,經(jīng)過40個循環(huán)后,PRRSV實時熒光RT-PCR方法對以上4個病毒株的檢測都呈陽性,PRSSV變異株實時熒光RT-PCR方法只對變異株PRRSV毒株(GDBY-3株、JX-A1株)檢測陽性,PRRSV弱毒疫苗株(Ch-1a株、ATCC VR-2332株)檢測都是陰性,因此可以有效區(qū)分PRRSV與PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)。豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和空白對照都無實時熒光值增長。顯示該檢測方法具有良好的特異性,能特異性的檢測PRRSV及其變異株(NSP2 1594～1680缺失)(圖1和圖2)。

圖1 PRRSV實時熒光RT-PCR檢測方法特異性擴增曲線Fig.1 Real-time PCR amplification curve of specificity for PRRSV

圖2 PRRSV變異株實時熒光RT-PCR檢測方法特異性 擴增曲線 Fig.2 Real-time PCR amplification curve of specificity for variant PRRSV

2.2.2 靈敏性試驗 GDBY-3株毒價經(jīng)測定為103.67TCID50/0.2 mL,兩種實時熒光RT-PCR檢測方法都能檢測到104倍稀釋的病毒培養(yǎng)液,相當于0.47個TCID50,105倍之后的病毒稀釋液檢測全部陰性(圖3和圖4)。

2.3 臨床可疑樣品檢測及與病毒分離方法的比較

對24個臨床可疑樣品進行病毒分離,分離到21株PRRSV,經(jīng)NSP2序列測定均為PRSSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)。本研究建立的方法均檢測到21份陽性,與病毒分離方法檢測結果一致(圖5和圖6)。

圖3 PRRSV實時熒光RT-PCR檢測方法靈敏度擴增曲線圖Fig.3 Sensitivity amplification curve of PRRSV real-time RT-PCR

圖4 PRRSV變異株實時熒光RT-PCR檢測方法靈敏度 擴增曲線圖 Fig.4 Sensitivity amplification curve of PRRSV variant strain real-time RT-PCR

圖5 PRRSV實時熒光RT-PCR臨床樣品擴增曲線Fig.5 Clinical sample amplification curve of PRRSV real-time RT-PCR

圖6 PRRSV變異株實時熒光RT-PCR臨床樣品 擴增曲線 Fig.6 Clinical sample amplification curve of PRRSV variant strain real-time RT-PCR

3 討論

我國于1996年首次分離到PRRSV,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)此病在國內(nèi)流行廣泛,并且都為美洲型PRRSV引起。國內(nèi)外均有關于PRRSV NSP2氨基酸缺失的報道[7-8],但出現(xiàn)兩個不連續(xù)位點缺失30個氨基酸的毒株,且在全國范圍內(nèi)廣泛流行并造成重大損失的高致病性PRRSV,2006年在我國屬于首次發(fā)現(xiàn)。PRRSV的NSP2是各毒株間差異較大的一個編碼區(qū),具有種特異性,美洲型和歐洲型PRRSV的氨基酸序列同源性只有32%,NSP2與PRRSV對細胞或組織的嗜性有關,在遺傳關系很近的毒株間也可有較大差異。NSP2基因序列的缺失是2006年我國暴發(fā)所謂“高熱病”以來豬場PRRSV分離株的一個顯著特征,且不同省市豬場流行的PRRSV相互之間高度同源,這些基因的缺失和結構蛋白基因序列的突變,可能與毒力的改變具有非常重要的相關性[9]。

郝曉芳等[10]曾建立了高致病性PRRSV RTPCR鑒定技術。然而,該方法的靈敏度方面與實時熒光RT-PCR技術比較有明顯的差距。范忠軍等[11]建立了針對PRRSV實時熒光RT-PCR檢測技術,并具有良好的效果,其主要是針對PRRSV基因組中保守的M蛋白基因,而M蛋白基因具有很強的群特異性,可以作為群特異性檢測的靶基因,無法區(qū)分傳統(tǒng)型PRRSV和PRRSV變異株。羅長保等[12]建立PRRSV變異株實時熒光RT-PCR檢測技術,其檢測的區(qū)域是NSP2基因,雖然國內(nèi)暫時分離到的PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)在NSP2同源性較高,但NSP2畢竟具有高突變性,不斷出現(xiàn)的新毒株容易在NSP2發(fā)生突變,而造成漏檢。本研究建立了同時針對PRRSV M基因和NSP2基因的實時熒光RT-PCR方法,其中針對NSP2基因的診斷方法可區(qū)分美洲型PRRSV和PRRSV變異株(NSP2 1594-1680缺失),針對保守的M基因的引物設計策略,還可有效防止因NSP2區(qū)突變而造成的漏檢。

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