珠三角地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定及序列分析*

黎丁滔,陳芳艷,陳瑞愛,晏勇邦,馮金牛,王林川*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642;2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興527400;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,廣東廣州510642)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)可引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、繁殖障礙等相關(guān)疾病[1-3],其中以PMWS最為嚴(yán)重。該病主要危害6周齡～12周齡仔豬,引起漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難、腹瀉和黃疸等,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)自2001年報(bào)道該病以來,在各省市均有不同程度的流行[4-5]。為了深入研究PCV-2在體外細(xì)胞培養(yǎng)增殖的特性,本研究從13份臨床PMWS病料中分離PCV-2毒株,經(jīng)細(xì)胞連續(xù)傳代,獲得13株細(xì)胞培育適應(yīng)毒,經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、間接免疫熒光試驗(yàn)及核酸序列分析等方法鑒定,證實(shí)分離株為PCV-2毒株,分別命名為PCV-2-FS1,PCV-2-FS2,PCV-2-ZQ1,PCV-2-ZQ2,PCV-2-YF,PCV-2-SD1,PCV-2-SD2,PCV-2-SS,PCV-2-SH,PCV-2-ZC,PCV-2-GZ1,PCV-2-GZ2,PCV-2-GZ3。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病料 無PCV-1污染的PK-15細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病實(shí)驗(yàn)室保存;13份病料(淋巴結(jié)、脾臟)采自珠三角地區(qū)(佛山、肇慶、云浮、順德、山水、四會(huì)、增城和廣州)臨床癥狀和剖檢病變疑似PMWS豬場,置于—80℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 DMEM、胎牛血清、熒光抗體FITC-羊抗豬IgG購于廣州美津生物技術(shù)有限公司;DNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、Ex Taq DNA聚合酶購于寶生物工程(大連)有限公司,PCV-2陽性血清、陰性血清(經(jīng)武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒檢測為陰性)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成 參照GenBank收錄的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性檢測引物,上游引物P1:5′-TATCCAAGGAGGCGTTAC-3′,下游引物P2:5′-GTAGT T TACATAGGGGTCATA-3′,擴(kuò)增片段為464 bp。參照GenBank收錄的豬圓環(huán)病毒2型全基因組序列合成兩對(duì)引物用于擴(kuò)增全基因組片段,上游引物P3:5′-ACCAGCGCACTTCGGCAGCGG-3′,下游引物P4:5′-CCTACCACTCCCGT TACT T-3′,擴(kuò)增1～1 273 bp的片段;上游引物P5:5′-ACATGGT TACACGGATAT TGT-3′,下游引物P6:5′-AATACTTACAGCGCACTTCT TTCG-3′,擴(kuò)增1 084 bp～1 768 bp的片段。以上引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2.3 模板的制備 13份病料研磨后用組織DNA提取試劑盒抽提DNA,于—20℃保存。

1.2.4 病料的PCR檢測 PCR的反應(yīng)體系:DNA模板2 μ L,上、下游引物各(20 mmol/L)1 μ L,10×buffer 5 μ L,dNTP(10 mmol/L)4 μ L,Ex TaqDNA聚合酶0.2 μ L,雙蒸水11.8 μ L。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃60 s,53℃60 s,72℃90 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L在10 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.2.5 病毒的分離 將病料研磨后反復(fù)凍融3次,上清用0.22 μ L的細(xì)菌濾器過濾除菌。取上清接種于PK-15細(xì)胞,24 h后用300 mmol/L D-氨基葡萄糖(D-glucosamine)37℃處理30 min,再培養(yǎng)48 h～72 h,將增殖病毒的細(xì)胞反復(fù)凍融3次,收集細(xì)胞毒液[6-7]。將毒液提取DNA后進(jìn)行PCR檢測,用陽性細(xì)胞毒液再接種細(xì)胞,共傳代6次。培養(yǎng)過程中同時(shí)設(shè)立不接毒的細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測 按照1.2.5的方法將第6代細(xì)胞毒液接種到PK-15細(xì)胞,37℃培養(yǎng)60 h后,用pH 7.2的PBS洗滌,洗滌后用900 mL/L的丙酮固定30 min;再用PBS洗滌3次,每次5 min;加PCV-2標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,對(duì)照組加陰性血清,37℃溫育1 h;再用PBS洗滌3次,每次5 min;加FITC標(biāo)記的羊抗豬IgG染色,37℃溫育1 h;最后用PBS洗滌3次,每次5 min,自然干燥后至于熒光顯微鏡下觀察[8-9]。

1.2.7 病毒的TCID50測定 先將細(xì)胞毒液用細(xì)胞維持液做10倍梯度稀釋,從10—1～10—8,然后將其接種到有PK-15的12孔細(xì)胞板上,每個(gè)梯度接種8孔,按照1.2.5的方法處理后,用間接免疫熒光試驗(yàn)測病毒的TCID50。

1.2.8 全基因組序列PCR的擴(kuò)增 用P3、P4和P5、P6兩對(duì)引物擴(kuò)增全基因組序列,PCR的反應(yīng)體系:DNA模板2 μ L,上、下游引物各(20 mmol/L)1 μ L,10×buffer 5 μ L,dNTP(10 mmol/L)4 μ L,Ex TaqDNA聚合酶0.2 μ L,雙蒸水11.8 μ L。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃60 s,56℃60 s,72℃90 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L在10 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。1.2.9 全基因組序列分析 兩個(gè)片段擴(kuò)增后連接于pMD18-T載體,經(jīng)PCR鑒定后送往測序。序列測定由廣州英駿生物技術(shù)公司完成。

2 結(jié)果

2.1 病料PCR擴(kuò)增結(jié)果

13份病料DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,表明擴(kuò)增出了464 bp大小的特異性片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 病料PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Identification of tissues from sick pigs by PCR

2.2 細(xì)胞毒液PCR擴(kuò)增結(jié)果

第1～6代細(xì)胞毒液抽提DNA后經(jīng)PCR檢測,均能擴(kuò)增出464 bp大小的特異性片段(圖2)。

圖2 第6代細(xì)胞毒液PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Identification of viruses from the sixth generation cell culture poison by PCR

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測結(jié)果

置于熒光顯微鏡下,在細(xì)胞內(nèi)觀察到了特異性的黃綠色熒光,陰性血清對(duì)照無黃綠色熒光(圖3)。

2.4 病毒的TCID50測定

利用間接免疫熒光對(duì)PCV-2-FS1,PCV-2-ZQ1,PCV-2-SD1,PCV-2-GZ1的第6代細(xì)胞毒的TCID50進(jìn)行測定,按Reed-Muench氏法計(jì)算(表1)。

圖3 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The results of IFA

表1 PCV-2毒株的TCID50結(jié)果T able 1 The results of TCID50of PCV-2 strains

2.5 全基因組序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

以8個(gè)不同地方毒株(PCV-2-FS1,PCV-2-ZQ1,PCV-2-YF,PCV-2-SD1,PCV-2-SS,PCV-2-SH,PCV-2-ZC,PCV-2-GZ1)的DNA為模板,分別用P3、P4和P5、P6兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果分別擴(kuò)增出了1273bp(圖4)和685 bp(圖5)的特異性片段,與預(yù)期結(jié)果相符。

圖4 P3、P4引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR results by using primer P3 and P4

圖5 P5、P6引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR results by using primer P5 and P6

2.6 全基因組序列分析結(jié)果

應(yīng)用DNA Star分析軟件將兩個(gè)片段重疊域拼接后得到了8個(gè)不同地區(qū)分離株(PCV-2-FS1,PCV-2-ZQ1,PCV-2-YF,PCV-2-SD1,PCV-2-SS,PCV-2-SH,PCV-2-ZC,PCV-2-GZ1)的全基因組序列,長度均為1 767 bp,通過Clustral W方法分別比對(duì)8個(gè)PCV-2分離株全基因組序列與GenBank已經(jīng)發(fā)表的PCV-2全基因組序列,包括美洲分離株(NC_005148,DQ364650)、英國分離株(AY325495)、中國分離株(AF381175,AF381176,AF381177)、中國臺(tái)灣分離株(AY180397)、加拿大分離株(AF027217)和澳大利亞分離株(AY754020)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同地域的PCV-2全基因組序列的差異很小,相似性在91.2%～99.8%之間,而本研究的8個(gè)PCV-2分離株之間全序列核苷酸相似性為94.2%～99.8%(圖6)。

圖6 PCV-2全基因組序列比對(duì)Fig.6 Homological comparison of the complete genomic sequences of PCV-2 strains

3 討論

PMWS是近年來新發(fā)現(xiàn)的、呈世界性流行分布的豬病毒性疾病,大量證據(jù)表明,PCV-2是引起該病的直接原因。PCV-2為DNA病毒,基因組很小,僅有1 768 bp或1 767 bp個(gè)堿基[10-13]。本研究先通過PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測,將陽性樣品處理后接種到細(xì)胞上,在細(xì)胞傳代過程中,每代均進(jìn)行PCR檢測,以證實(shí)病毒在細(xì)胞中繁殖。同時(shí),以PK-15細(xì)胞作陰性對(duì)照,將病理材料在細(xì)胞上連續(xù)傳6代,仍然可從細(xì)胞上檢測出PCV-2,說明病毒已經(jīng)適應(yīng)PK-15細(xì)胞,已成功將毒株分離出來。

本研究利用間接免疫熒光鑒定病毒時(shí)選取了DGlucosamine誘導(dǎo)60 h后的感染細(xì)胞,在感染細(xì)胞中觀察到了大量免疫熒光,文獻(xiàn)報(bào)道[4,9]和我們的電鏡觀察結(jié)果一致,由于收毒時(shí)間較晚,病毒抗原轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞漿中或病毒借助細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)在細(xì)胞漿中合成了病毒抗原[14]。說明我們觀察到的熒光是PCV-2特異性的。

PCV-2在細(xì)胞上的培養(yǎng)滴度非常低,很多疫苗生產(chǎn)廠家基于成本太高,放棄了開發(fā)PCV-2滅活疫苗的打算,因此如何提高PCV-2在細(xì)胞上的滴度應(yīng)該也是今后研究的工作重點(diǎn)之一。董信田等[15]分離出來的PCV-2-SH滴度較高,達(dá)到10—5.0TCID50/mL,用此毒株制備的滅活苗有很好的效果。本研究所分離的PCV-2-ZQ1毒株,毒價(jià)較高,經(jīng)6代傳代之后為10—6.01TCID50/mL,有作為疫苗研究的價(jià)值。另外,不同毒株的毒價(jià)差異是否與其致病性有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

應(yīng)用DNA Star分析軟件將兩個(gè)片段重疊區(qū)域拼接后得到了8個(gè)不同地方分離株的全基因組序列,長度均為1 767 bp,與PCV-2的另一亞型(1 768 bp)相比,在1042位缺失1個(gè)堿基T。將與其他序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)全序列核苷酸相似性在91.2%～99.8%之間,而本研究的8個(gè)PCV-2分離株之間全序列核苷酸相似性為94.2%～99.8%。這表明不同地域和地區(qū)的PCV-2存在一些差異,但是PCV-2全基因組從總體上來說遺傳進(jìn)化相對(duì)穩(wěn)定,本研究分離的8個(gè)毒株彼此關(guān)系密切,沒有因?yàn)闀r(shí)間和地區(qū)的不同發(fā)生較大的變異,這可能與本地區(qū)習(xí)慣性引種有關(guān)。

[1] Allan G M,Mc Neilly F,Meehan B M,et al.Isolation and characterization of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain,Denmark and Northern Ireland[J].Vet Microbiol,1999,66(2):115-123.

[2] Hamel A L,Lin L L,Nayar G P.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with post weaning multi systemic wasting syndrome in pigs[J].Virology,1998,72(6):5262-5267.

[3] 陳 濤,閆若潛,謝彩華,等.豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的表達(dá)及活性研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(2):35-38.

[4] 郎洪武,王 力,張廣川,等.豬圓環(huán)病毒分離鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征的診斷[J].中國獸醫(yī)科技,2001,31(3):3-5.

[5] 于 周,李 俊,程凱慧,等.豬圓環(huán)病毒2型毒株的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(1):19-20.

[6] 何世成,劉道新,張 志,等.豬圓環(huán)病毒2型湖南株的分離與序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(1):31-35.

[7] 白 靜,梁月麗.豬圓環(huán)病毒河南株的分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(13):5444-5445.

[8] 蘆銀華,談國蕾,華修國,等.應(yīng)用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測豬圓環(huán)病毒抗體[J].中國獸醫(yī)科技,2002,32(8):19-20.

[9] 崔尚金,全滟平,李 曦,等.豬圓環(huán)病毒間接免疫熒光方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(1):19-20.

[10] 徐紹建,李 俊,曹 帥,等.豬圓環(huán)病毒2型全序列分析及感染性克隆的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(1):21-22.

[11] 柳美玲,秦曉冰,王愛華,等.豬圓環(huán)病毒2型山東分離株全基因組的克隆與序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(1):13-17.

[12] 王生育,顏江華,孔繁德,等.豬圓環(huán)病毒2型ORF1和O RF2基因的克隆與表達(dá)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(12):934-937.

[13] 何逸民,羅玉均,潘全會(huì),等.兩株豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(11):4-7.

[14] 呂艷麗,楊漢春,郭 鑫,等.豬圓環(huán)病毒2型的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2004,40(2):14-18.

[15] 董信田,李玉峰,姜 平,等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備與免疫效力研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(5):639-644.