氟比洛芬脂質(zhì)體的制備及其載藥性能研究

陳柳華,甘禮華,趙云輝,劉明賢

(同濟(jì)大學(xué) 化學(xué)系,上海 200092)

脂質(zhì)體是1965年英國(guó)學(xué)者Bangham等將磷脂分散在水中進(jìn)行電鏡觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的[1],它作為模擬體系在推動(dòng)生物膜的研究進(jìn)展中起著非常重要的作用.20世紀(jì)70年代以后,研究人員開始將它作為藥物分子的載體,嘗試用于臨床診斷、治療等方面的研究[2].構(gòu)成脂質(zhì)體雙分子層的物質(zhì)主要是磷脂和膽固醇(cholesterol),其分子結(jié)構(gòu)中既具有親水基團(tuán)又具有疏水基團(tuán),因此,脂質(zhì)體的親水基團(tuán)夾層中可以包封水溶性藥物,而脂質(zhì)體的疏水基團(tuán)夾層中則可以包封脂溶性藥物[3].脂質(zhì)體作為藥物載體既可以起到對(duì)藥物的緩釋作用,又可以提高藥物對(duì)機(jī)體特定部位的靶向性,在提高藥效方面具有明顯的優(yōu)越性.脂質(zhì)體的制備方法主要有薄膜蒸發(fā)-超聲分散法、逆相蒸發(fā)法、注入法、冷凍干燥法、硫酸銨梯度法等,其中,薄膜蒸發(fā)-超聲分散法是脂質(zhì)體制備方法中最傳統(tǒng)且應(yīng)用最廣泛的方法.

氟比洛芬(flurbiprofen)是非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥中優(yōu)秀品種之一,被廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、外傷疼痛和其它疼痛.該藥物口服有效,耐受性好,長(zhǎng)期使用既不促進(jìn)也不抑制自身代謝[4].然而,氟比洛芬生物利用度差,且具有較嚴(yán)重的胃腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等不良反應(yīng)[5].為了降低氟比洛芬的毒副作用,丁雪鷹等[6]制備了氟比洛芬巴布劑,巴布劑是一種經(jīng)皮給藥制劑,它的應(yīng)用可以避免胃腸道不良反應(yīng),提高患部藥物濃度,增強(qiáng)抗炎作用.脂質(zhì)體作為藥物載體,既適合經(jīng)皮給藥,又適合經(jīng)口給藥,其雙分子層與生物膜有較大的相似性以及組織相溶性,易于被人體組織吸收,從而提高了藥物的生物利用度[7].同時(shí),脂質(zhì)體對(duì)機(jī)體無(wú)毒或毒副作用小,因此,氟比洛芬脂質(zhì)體的制備及其載藥性能研究具有重要意義.本文采用薄膜蒸發(fā)-超聲分散法制備氟比洛芬脂質(zhì)體,通過魚精蛋白凝聚法測(cè)定脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的包封率和載藥率,研究卵磷脂(lecithin)濃度、氟比洛芬/卵磷脂的質(zhì)量比、膽固醇濃度對(duì)脂質(zhì)體載藥性能的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

材料為蛋黃卵磷脂、膽固醇、氯仿(分析純,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司),氟比洛芬(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,Tokyo Kaset Kogyo Co.Ltd)、氫氧化鉀(分析純,上海同試化工有限公司)、磷酸二氫鉀(分析純,上海恒信化學(xué)試劑有限公司)、氯化鈉(分析純,江蘇強(qiáng)盛化工有限公司)、魚精蛋白(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).儀器為紫外-可見吸收光譜儀(Agilent 8453)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)、透射電鏡(JEOL JEM-1230).

1.2 氟比洛芬脂質(zhì)體的制備

將一定量的卵磷脂、氟比洛芬和膽固醇溶于30 mL的甲醇-氯仿溶液中(氯仿與甲醇的體積比為2∶1),用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法在40℃溫度下除去氯仿與甲醇,直至燒瓶?jī)?nèi)壁形成一層脂質(zhì)膜,通氮?dú)?0 min以除去殘留溶劑.將50 mL磷酸緩沖液(pH =7.8)加入脂質(zhì)膜中,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下旋渦2 h,超聲15 min,經(jīng)0.45 μ m濾膜過濾制得氟比洛芬脂質(zhì)體.

1.3 透射電鏡分析

通過負(fù)染透射電鏡技術(shù)觀察脂質(zhì)體的形貌.將脂質(zhì)體滴在具有Formvar(polyvinyl formal)膜的銅網(wǎng)上,吸附25 min后,滴加染色液磷鎢酸,烘干后用透射電鏡觀測(cè)脂質(zhì)體的形貌.

1.4 紫外-可見吸收光譜分析

1.4.1 氟比洛芬在水/脂質(zhì)體體系中的分配系數(shù)

測(cè)定不同濃度的氟比洛芬脂質(zhì)體的紫外-可見吸收光譜,掃描的波長(zhǎng)范圍為200～500 nm,通過其在247 nm處的紫外特征吸收峰強(qiáng)度,計(jì)算氟比洛芬在水/脂質(zhì)體體系中的分配系數(shù).

1.4.2 氟比洛芬脂質(zhì)體的載藥性能

將0.1 mL氟比洛芬脂質(zhì)體置于10 mL的離心管中,加入0.2 mL質(zhì)量濃度為10 mg?mL-1魚精蛋白溶液,混合均勻后,靜置3 min.然后往離心管中加入10 mL磷酸緩沖液,3 000 r?min-1離心30 min.取上層清液,用紫外-可見吸收光譜儀測(cè)定游離的氟比洛芬的吸光度,根據(jù)溶液的吸光度與氟比洛芬濃度的線性關(guān)系,計(jì)算未被包封的氟比洛芬濃度.將0.1 mL氟比洛芬脂質(zhì)體溶解在10 mL的乙醇中,通過紫外-可見吸收光譜儀測(cè)定脂質(zhì)體體系中氟比洛芬的吸光度,并由此計(jì)算氟比洛芬脂質(zhì)體體系中氟比洛芬的含量.脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的包封率(EE)和載藥率(DL)分別通過如下公式計(jì)算得到[8]:

式(1),(2)中:Wtotal是氟比洛芬的總質(zhì)量;Wfree是未被包封的氟比洛芬的質(zhì)量;Wlipid是卵磷脂的質(zhì)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 氟比洛芬在水/脂質(zhì)體體系中的分配系數(shù)

分配系數(shù)KD是指組分在磷脂相中濃度與組分在水相中濃度的比例[9],它是反映藥物在生物膜中分配的一個(gè)重要參數(shù).圖1是脂質(zhì)體中卵磷脂濃度不同時(shí)氟比洛芬的紫外-可見吸收光譜,氟比洛芬濃度(cf)為5.0×10-5mol?L-1.由圖1可知,247 nm處吸收峰是氟比洛芬在紫外-可見吸收光譜中的特征吸收峰.隨著卵磷脂濃度的增加,氟比洛芬在247 nm處的紫外特征吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng).根據(jù)氟比洛芬在脂質(zhì)體中的紫外-可見吸收光譜的測(cè)定結(jié)果,用公式(3)計(jì)算氟比洛芬在卵磷脂相與水相中的分配系數(shù)KD[10].

式中:εφ為氟比洛芬在指定波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù); εm和εw分別為氟比洛芬在卵磷脂脂質(zhì)體磷脂相和水相中的摩爾吸光系數(shù);cl為卵磷脂的濃度;KD為分配系數(shù).摩爾吸光系數(shù) εφ和εw由所得的氟比洛芬脂質(zhì)體體系中氟比洛芬在247 nm處的紫外-可見吸收峰強(qiáng)度計(jì)算而得到.以1/(εφ-εw)對(duì)1/cl作圖,如圖1所示,按照公式(3)計(jì)算得到氟比洛芬在卵磷脂相和水相中的分配系數(shù)KD為815.6,由此可知,氟比洛芬是具有較大的分配系數(shù)的藥物,該藥物容易滲透通過生物膜而被脂質(zhì)體包埋,因此,氟比洛芬脂質(zhì)體具有較良好的載藥性能.

圖1 卵磷脂濃度不同時(shí)氟比洛芬溶液的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-vis spectroscopy of flurbiprofen solution at different concentrations of lecithin

2.2 氟比洛芬脂質(zhì)體的形成過程

氟比洛芬脂質(zhì)體的形成過程主要是基于卵磷脂分子之間的締合作用以及卵磷脂分子與氟比洛芬分子之間的疏水作用[11].將卵磷脂、氟比洛芬和膽固醇的甲醇-氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去燒瓶?jī)?nèi)有機(jī)溶劑(氯仿和甲醇)后,卵磷脂分子和氟比洛芬分子均勻分散在燒瓶?jī)?nèi)壁并形成一層脂質(zhì)膜.當(dāng)脂質(zhì)膜分散在40℃磷酸緩沖液中旋渦浸泡時(shí),脂質(zhì)膜從燒瓶?jī)?nèi)壁脫落,脫落的卵磷脂分子通過疏水締合作用在磷酸緩沖液中相互靠攏,定向排列形成一個(gè)類球狀的、包封一部分水相的封閉囊泡即脂質(zhì)體,卵磷脂分子的親水性基團(tuán)形成脂質(zhì)體雙層類脂膜的內(nèi)外表面,卵磷脂分子的疏水性基團(tuán)形成脂質(zhì)體雙層類脂膜內(nèi)側(cè).

紫外-可見吸收光譜研究表明,氟比洛芬在水/脂質(zhì)體體系中的分配系數(shù)KD為815.6,它是一種脂溶性較強(qiáng)的藥物,通過與卵磷脂分子的疏水作用定位于脂質(zhì)體疏水基團(tuán)的夾層中形成氟比洛芬脂質(zhì)體,所得氟比洛芬脂質(zhì)體的透射電鏡照片如圖2所示.由圖2可見,得到的脂質(zhì)體為球狀或近球狀的封閉囊泡,這種囊泡具有雙分子層結(jié)構(gòu),其粒徑在100～250 nm之間,大小比較均勻,分散性良好,空白脂質(zhì)體的平均粒徑大約為120 nm,隨著氟比洛芬的濃度增大,脂質(zhì)體的平均粒徑不斷增大,當(dāng)氟比洛芬濃度為2×10-5mol?L-1,脂質(zhì)體的平均粒徑增加至150 nm左右.

2.3 氟比洛芬脂質(zhì)體載藥性能的影響因素

圖2 氟比洛芬脂質(zhì)體的透射電鏡照片F(xiàn)ig.2 TEM photographs of flurbiprofen liposomes

不同濃度的氟比洛芬溶液的紫外-可見吸收光譜如圖3所示,以247 nm處的吸光度對(duì)濃度作圖,得一直線,圖中氟比洛芬溶液的吸光度與其濃度呈良好的線性關(guān)系,根據(jù)此線性關(guān)系可以計(jì)算氟比洛芬脂質(zhì)體的載藥率和包封率,以此考察卵磷脂濃度、氟比洛芬對(duì)卵磷脂的質(zhì)量比以及膽固醇濃度對(duì)氟比洛芬脂質(zhì)體載藥性能的影響.

2.3.1 卵磷脂濃度

脂質(zhì)體的包封率是指包封于脂質(zhì)體中的藥物量占脂質(zhì)體系中藥物總量的比例,它是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體制劑質(zhì)量好壞的重要指標(biāo),也是其能否發(fā)揮較普通制劑高效、低毒特點(diǎn)的關(guān)鍵[12].包封率越高,游離藥物越少,即藥物緩釋效果越好,藥物的毒副作用越低.而脂質(zhì)體的載藥率則是指脂質(zhì)體所能載的藥物量,它是評(píng)價(jià)載體材料載藥性能的一項(xiàng)重要指標(biāo),載藥率愈高載藥性能愈好.圖4是卵磷脂濃度對(duì)氟比洛芬脂質(zhì)體包封率和載藥率的影響.由圖4可知,當(dāng)卵磷脂濃度為2.7×10-4mol?L-1時(shí),氟比洛芬脂質(zhì)體的包封率為39%,載藥率為49.9%;當(dāng)卵磷脂濃度為4.0×10-4mol?L-1時(shí),氟比洛芬脂質(zhì)體的包封率為46%,載藥率為38.4%;當(dāng)卵磷脂濃度為5.4×10-4mol?L-1時(shí),氟比洛芬脂質(zhì)體的包封率為54%,載藥率為34.6%.由此可知,隨著卵磷脂濃度的增加,脂質(zhì)體的包封率增加,載藥率降低.不過,當(dāng)卵磷脂濃度大于5.4×10-4mol?L-1時(shí),所得脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差,脂質(zhì)體的包封率隨卵磷脂濃度增加變化不大,而脂質(zhì)體的載藥率卻不斷降低.

圖3 氟比洛芬的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-vis absorption spectra of flurbiprofen solution

2.3.2 氟比洛芬對(duì)卵磷脂的質(zhì)量比

脂質(zhì)體通過將脂溶性藥物鑲嵌在磷脂雙分子層中實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的包載,藥物與磷脂的相容性以及藥物與磷脂的比例會(huì)顯著影響脂質(zhì)體的載藥性能[13].圖5是卵磷脂質(zhì)量(ml)不變的情況下,改變氟比洛芬質(zhì)量(mf)對(duì)脂質(zhì)體包封率和載藥率的影響.由圖5可知,當(dāng)氟比洛芬用量增加時(shí),脂質(zhì)體的載藥率增大,這是由于氟比洛芬能夠通過疏水作用定位于脂質(zhì)體疏水基團(tuán)的夾層中,而當(dāng)氟比洛芬用量較小時(shí),脂質(zhì)體攜帶的氟比洛芬分子較少,尚未達(dá)到飽和.隨著氟比洛芬用量的繼續(xù)增加,定位于脂質(zhì)體中的氟比洛芬分子逐漸增多,使得脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的載藥率也逐漸增大.然而隨著氟比洛芬用量的增加,脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的包封率降低,這是因?yàn)殡m然脂質(zhì)體所能攜帶氟比洛芬分子的數(shù)量增加,但體系中未被脂質(zhì)體包封的氟比洛芬也在增加,根據(jù)公式(1)可知,氟比洛芬濃度增加使得未包封的氟比洛芬分子數(shù)目變得過多,從而導(dǎo)致脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的包封率降低.

圖4 卵磷脂濃度對(duì)氟比洛芬脂質(zhì)體包封率和載藥率的影響Fig.4 Effect of lecithin concentration on the entrapment efficiency and drug loading of liposomes

圖5 氟比洛芬對(duì)卵磷脂的質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封率和載藥率的影響Fig.5 Effect of flurbiprofe n/lipid mass ratio on the entrapment efficiency and drug loading of liposomes

2.3.3 膽固醇濃度

脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性是脂質(zhì)體的一個(gè)重要物理性質(zhì),在相變溫度時(shí),膜的流動(dòng)性增加,被包裹的藥物極易泄露,因此,膜的流動(dòng)性直接影響著脂質(zhì)體的穩(wěn)定性.膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用,在低于相變溫度時(shí)可以減少膜的有序性而增加膜的流動(dòng)性,高于相變溫度時(shí)可以增加膜的有序排列而減少膜的流動(dòng)性[14].在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在脂質(zhì)體的制備過程中,加入少量的膽固醇可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性.圖6是改變膽固醇質(zhì)量(mc)對(duì)氟比洛芬脂質(zhì)體載藥性能的影響.由圖6可知,當(dāng)膽固醇對(duì)卵磷脂的質(zhì)量比從0增加到0.3時(shí),脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的包封率和載藥率幾乎沒有變化;當(dāng)膽固醇對(duì)卵磷脂的質(zhì)量比分別為0.60,0.75, 1.00和1.50時(shí),脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的包封率從54.0%降低至51.0%,43.6%,43.8%,42.3%,載藥率從34.6%降低至32.6%,27.9%,28.0%,26.8%.這是由于脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)被過量的膽固醇干擾的結(jié)果.氟比洛芬是疏水性藥物,其本身是嵌入磷脂形成的雙分子層之間,因此,膜的面積越大,藥物包封率就越高.然而,膽固醇本身并不形成雙分子層結(jié)構(gòu),它能夠鑲嵌入雙層膜中占據(jù)一定的空間,膽固醇的含量過高,使膜的剛性增強(qiáng),曲率變小,所形成的脂質(zhì)體的總表面積減小,從而引起載藥率和包封率的降低.這表明,雖然膽固醇的加入能夠增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,但是過量的膽固醇卻會(huì)造成脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬載藥率和包封率的降低.因此,在制備氟比洛芬脂質(zhì)體時(shí),膽固醇對(duì)卵磷脂的質(zhì)量比應(yīng)該控制在0.3以內(nèi).

圖6 膽固醇濃度對(duì)氟比洛芬脂質(zhì)體包封率和載藥率的影響Fig.6 Effect of cholesterol concentration on the entrapment efficiency and drug loading of liposomes

3 結(jié)論

通過薄膜蒸發(fā)-超聲分散法制備氟比洛芬脂質(zhì)體,研究了氟比洛芬脂質(zhì)體載藥性能的影響因素.氟比洛芬定位于脂質(zhì)體的疏水基團(tuán)區(qū)域,隨著氟比洛芬用量的增加,脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的載藥率增大,包封率降低.膽固醇可調(diào)節(jié)膜的穩(wěn)定性,其本身并不形成雙分子層結(jié)構(gòu),它能夠鑲嵌于雙層膜中,少量的膽固醇對(duì)脂質(zhì)體的包封率和載藥率影響不大,膽固醇濃度過高導(dǎo)致脂質(zhì)體對(duì)氟比洛芬的載藥率和包封率降低.

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