青蒿琥酯對(duì)人卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的抑制效應(yīng)

楊素梅 劉可玲 王立敏 高建宏 李華 高玉霞

卵巢癌患者病死率在女性生殖道腫瘤中居首位。高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率導(dǎo)致卵巢癌患者5年生存率長(zhǎng)期徘徊在30%左右。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤新生血管形成。血管新生(angiogenesis)是指在原有血管基礎(chǔ)上形成新的微小血管，是大多數(shù)惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的前提［1］。本實(shí)驗(yàn)通過研究青蒿琥酯(artesunate，ART)對(duì)人卵巢癌CAOV3細(xì)胞促血管新生效應(yīng)的影響及其機(jī)制，以進(jìn)一步明確ART抗卵巢癌作用機(jī)制，探索卵巢癌治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 人卵巢癌CAOV3細(xì)胞由上海細(xì)胞生物研究所提供。ART購于桂林南藥股份有限公司(批號(hào):090902;批準(zhǔn)文號(hào)，國(guó)H:10930187)，使用前5%碳酸氫鈉注射液溶解。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒購于深圳晶美生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌CAOV3細(xì)胞在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的RPMI-1640中37℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌CAOV3細(xì)胞，分別給予不同濃度ART處理(ART處理組)。單純RPMI-1640培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，無藥物作用的卵巢癌CAOV3細(xì)胞為陽性對(duì)照。

1.3 條件培養(yǎng)液收集 按照Kini等［2］的方法，首先將卵巢癌CAOV3細(xì)胞放入RPMI-1640不加或加入不同濃度的ART中培養(yǎng)48 h，然后用RPMI-1640將RPMI-8226細(xì)胞沖洗3次，并在無血清1640液中孵育4 h;收集細(xì)胞后用無血清1640液稀釋至1×106個(gè)/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。臺(tái)盼蘭排除試驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌CAOV3細(xì)胞的活力 ＞95%。無菌條件下 1 200 r/min和12 000 r/min分別離心10 min，制條件培養(yǎng)液，保存于-80℃。

1.4 主動(dòng)脈環(huán)體外生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 取大鼠胸主動(dòng)脈，切成1 mm長(zhǎng)的主動(dòng)脈環(huán)。首先將1.2 mg纖維蛋白原和0.5 U牛凝血酶溶于無血清培養(yǎng)液MCDB-131，加于24孔板，待形成凝膠后，放入主動(dòng)脈環(huán)，再加入纖維蛋白原和牛凝血酶，使成凝膠，以固定新生血管，加入培養(yǎng)液MCDB-131 1 ml，放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。在前 3 d，培養(yǎng)基中還需加入 ε-氨基己酸(300 μg/ml)以抑制纖維蛋白溶解。3 d后，加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的條件培養(yǎng)液，與主動(dòng)脈環(huán)一起孵育。另單獨(dú)加同容量RPMI-1640作為陰性對(duì)照。每天在倒置顯微鏡下觀察新生血管生長(zhǎng)情況，直到第15天血管生成達(dá)到高峰。每組取6個(gè)主動(dòng)脈環(huán)，計(jì)數(shù)新生血管數(shù)。

1.5 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內(nèi)血管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 將孵化4 d的雞胚，在近氣室處開0.5 cm×1.0 cm窗，暴露接種部位(CAMs)。置孵箱內(nèi)穩(wěn)定24 h后，按如下方式分組處理:(1)陰性對(duì)照組:浸有RPMI-1640約1 mm3大小的可吸收明膠海綿，無菌置于雞胚CAM，作為陰性對(duì)照組。(2)單純CAOV3細(xì)胞組:在第6天，將浸有100 μl CAOV3細(xì)胞懸液(CAOV3細(xì)胞含量為5×106)的可吸收明膠海綿，無菌置于雞胚CAM。(3) ART處理組:將陰性對(duì)照組雞胚額外孵育1 d后，在第8天取出部分雞胚，給予不同濃度的ART。所有接種后的雞胚用消毒的半透明封口膜封口，窗垂直向上，送回孵箱中孵育。每天檢查CAM直到第12天，小心剝離各雞胚CAM，用固定液(甲醇、丙酮等比混合液)固定后拍照。

1.6 ELISA測(cè)定 終濃度為0、3、6和12 μmol/L ART處理CAOV3細(xì)胞48 h后，收集條件培養(yǎng)液。按照人VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，測(cè)定條件培養(yǎng)液中VEGF含量。最小檢測(cè)限度為30 pg/L。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用Dunnett’st檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ART對(duì)大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管生成的影響 單純CAOV3細(xì)胞組第3天起鏡下可見有新生血管生成，第7～13天新生血管迅速增多，第14天后血管生成減慢并逐漸減少。ART預(yù)處理組新生血管形成以時(shí)間依賴方式減少，且形成時(shí)間明顯滯后，于第7～10天鏡下才觀察到有新生血管出現(xiàn)。同時(shí)ART處理組血管萌芽密度明顯降低。至第14天，陰性對(duì)照組新生血管數(shù)為(61.2±6.3);3、6和12 μmol/L ART預(yù)處理組新生血管數(shù)分別為(53.2±3.9)、(32.8±4.1)和(12.6±2.8)μmol/L，與單純CAOV3細(xì)胞組新生血管數(shù)(129.5±8.9)μmol/L比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 ART對(duì)CAOV3細(xì)胞誘導(dǎo)的CAM血管新生的影響 與陰性對(duì)照組比較，單純CAOV3細(xì)胞組表現(xiàn)出很強(qiáng)的刺激血管新生能力，眾多新生微血管呈放射狀排列于海綿周圍，血管密度、分支明顯增多，管徑增粗。而ART處理組刺激血管新生能力明顯減弱，血管密度、分支減少，管徑變細(xì)。3、6和12 μmol/L ART處理組與單純RPMI-8226細(xì)胞組比較，微血管數(shù)目分別減少21.9%，38.24%，76.9%(P＜0.01)。見圖1，表1。

圖1 ART對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗(yàn)中CAOV3細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的影響

表1 各ART處理組雞胚絨毛尿囊膜血管數(shù)

2.3 ART對(duì)CAOV3細(xì)胞條件培養(yǎng)液中VEGF含量的影響單純CAOV3細(xì)胞組中VEGF含量為(587±62)pg/ml。與單純CAOV3組相比，經(jīng)3、6、12 μmol/L ART處理的RPMI-8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中VEGF含量以劑量依賴方式下降，分別為(462± 72)、(232±44)和(151±14)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，易于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其致死的主要原因，腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移依賴大量腫瘤新生血管形成。研究發(fā)現(xiàn):癌組織中存在顯著血管生成現(xiàn)象［3］;多項(xiàng)卵巢癌病例回顧性研究亦提示，卵巢癌組織微血管密度與臨床分期有關(guān)，是該疾病生存和復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素［4］。在本研究血管生成實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組、藥物干預(yù)組相比，卵巢癌細(xì)胞組的主動(dòng)脈環(huán)血管萌芽數(shù)和雞胚尿囊膜血管密度均顯著增加，進(jìn)一步提示卵巢癌細(xì)胞具有極強(qiáng)促血管生成能力。

ARI是半合成的青蒿素衍生物，其高效低毒的抗瘧效應(yīng)得到肯定，同時(shí)其對(duì)多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的生長(zhǎng)抑制作用也越來越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者注意［5］。汪向紅等［6］用不同濃度ART處理體外培養(yǎng)的人卵巢癌CAOV3細(xì)胞，結(jié)果顯示ART可顯著抑制CAOV3細(xì)胞增殖。近年來有報(bào)道認(rèn)為ART具有抗腫瘤血管新生的作用［7］。體外研究顯示ART可通過減少VEGF表達(dá)，抑制白血病K562細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)ART可強(qiáng)烈抑制Kaposi肉瘤鼠模型腫瘤組織內(nèi)血管的發(fā)生發(fā)展［8］。但ART對(duì)人卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的影響作者尚未見報(bào)道。本研究選用3個(gè)較低濃度ART(3、6、12 μmol/L，胎盤藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞活力 ＞95%)［9］，觀察其對(duì)人卵巢癌CAOV3細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的影響。體外主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與單純CAOV3細(xì)胞組相比，ART處理組主動(dòng)脈環(huán)上血管萌芽形成明顯推遲，密度顯著減少。提示ART對(duì)人卵巢癌CAOV3細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的血管新生具有抑制作用。體內(nèi)CAM血管生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦支持上述結(jié)論:與單純CAOV3細(xì)胞組相比，ART處理組血管分支明顯減少，密度顯著下降。進(jìn)一步表明ART具有抗人卵巢癌CAOV3細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的能力。結(jié)合汪向紅等［6］發(fā)表的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究認(rèn)為ART具有抑制人卵巢癌細(xì)胞增殖分化、干擾卵巢癌血管新生的雙重作用。其抗血管新生作用機(jī)制一方面與ART直接抑制血管萌芽形成等血管新生過程有關(guān)，另一方面還可能與ART間接影響促血管新生調(diào)控因子表達(dá)有關(guān)［10］。

VEGF是血管形成過程中最強(qiáng)有力的調(diào)控因子，其與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，并最終形成新生血管。許多卵巢癌患者血漿VEGF水平明顯高于正常人，是判斷卵巢癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等臨床過程的重要標(biāo)記物［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度ART即可抑制人卵巢癌CAOV3細(xì)胞分泌VEGF。VEGF表達(dá)減少一方面可能加強(qiáng)ART抑制腫瘤血管新生的效應(yīng);另一方面還可能減弱VEGF對(duì)卵巢癌細(xì)胞自分泌增殖促進(jìn)作用［11］，抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。由此可見，ART很可能為卵巢癌臨床治療提供一條新途徑。

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