克霉唑乳膏微生物限度檢查方法學(xué)研究＊

(重慶市藥品檢驗所，重慶 401121)

克霉唑乳膏屬抗真菌藥，臨床用于治療各種皮膚癬、念珠菌性甲溝炎和念珠菌性外陰陰道炎。該藥全國現(xiàn)有批準(zhǔn)文號8個，涉及6個生產(chǎn)廠家和2個規(guī)格，2個規(guī)格分別為1%和3%，但市場上抽到的卻有幾十家生產(chǎn)企業(yè)的該藥產(chǎn)品。查詢國家食品藥品監(jiān)督管理局相關(guān)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫資料，發(fā)現(xiàn)目前許多上市銷售的克霉唑乳膏，根據(jù)其批準(zhǔn)文號溯源查詢，其產(chǎn)品名稱均為克霉唑軟膏。而克霉唑軟膏的批準(zhǔn)文號共有98個，因此使得該樣品所用基質(zhì)存在較大差異。為此，筆者對各藥品說明書中所列出的輔料進行比較，選出了幾個有代表性的樣品，并對其微生物限度檢查方法學(xué)進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 樣品與培養(yǎng)基

克霉唑乳膏:江西杏林白馬藥業(yè)有限公司(規(guī)格為1%，批號為20071201);新鄉(xiāng)市琦寧藥業(yè)有限公司(規(guī)格為1%，批號為20080301，20080305);廣東順峰藥業(yè)有限公司(規(guī)格為3%，批號為20080101);重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司(規(guī)格為3%，批號為070909);北京雙吉制藥有限公司(規(guī)格為3%，批號為080454);青島國風(fēng)維奧制藥有限公司(規(guī)格為3%，批號為080201);楊凌生物醫(yī)藥科技股份有限公司(規(guī)格為3%，批號為20080101);天津藥業(yè)集團有限公司(規(guī)格為1%，批號為0802032)。共8個廠家9個批次的樣品。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號為080710)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號為080821)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號為080617)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號為080626)、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號為080716)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號為080919)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號為090203)、十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號為081021)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 儀器

全封閉薄膜過濾器，由杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)48 h上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)小于100 CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)7 d，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)小于100 CFU的孢子懸液。菌懸液每次試驗前新鮮配制，備用。

2.2 細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查方法學(xué)考察

2.2.1 普通直接接種法

首先采用pH=7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液將克霉唑乳膏分散后，制成1∶10的供試液;取供試液1 mL和2.1項下制備的試驗菌菌懸液1 mL，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備兩皿，按平皿法測定其菌數(shù);另同法測定所加的試驗菌數(shù)。結(jié)果菌回收率金黃色葡萄球菌為38%，大腸埃希菌為55%，枯草芽孢桿菌為23%，白色念珠菌為0，黑曲霉為1%，說明克霉唑乳膏對細(xì)菌、霉菌和酵母菌均有一定的抑制作用。

2.2.2 培養(yǎng)基稀釋法

根據(jù)2.2.1項的試驗結(jié)果對試驗方法進行了調(diào)整，采用培養(yǎng)基稀釋法進行試驗。每1 mL供試液(1∶10稀釋液)等量分注5皿，每皿加供試液0.2 mL，進行回收率試驗。結(jié)果菌回收率金黃色葡萄球菌為65%，大腸埃希菌為73%，枯草桿菌為48%，白色念珠菌為2%、黑曲霉為10%，說明培養(yǎng)基稀釋法能夠較好地去除克霉唑乳膏對大腸埃希菌的抑菌作用，但對其他菌仍有一定的抑菌作用。

2.2.3 薄膜過濾法

稀釋液選擇:由于培養(yǎng)基稀釋法不能很好地去除樣品的抑菌作用，故決定采用薄膜過濾法對樣品進行處理后進行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)檢查。因薄膜過濾法需考慮樣品在稀釋劑中的分散效果以及過濾情況，故對其分散劑進行了系統(tǒng)考察。分別選擇pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液、十四烷酸異丙酯作為稀釋劑，以及先加入吐溫80乳化后再加入緩沖液分散的方法進行試驗。結(jié)果樣品于十四烷酸異丙酯中不能分散，加吐溫80進行乳化后分散效果改善不明顯，意義不大。經(jīng)摸索比較，最終確定的樣品分散方法為，取克霉唑乳膏10 g，加恒溫(45℃)的pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL

沖洗量選擇:由于克霉唑不溶于水，為考察樣品過濾后克霉唑是否還對霉菌及酵母菌計數(shù)產(chǎn)生影響，先取樣品10 g，加恒溫至45℃的pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，直接過濾而不進行沖洗，以白色念珠菌作為試驗菌并延長觀察時間。結(jié)果樣品陽性組生長較陽性對照組緩慢，但在第5天回收率可達38%，較其他方法回收率有明顯提高，顯示薄膜過濾應(yīng)該能去除樣品中克霉唑的影響，若進行沖洗，則能更好地去除樣品中克霉唑的影響。分別采用200，500，800 mL的沖洗量對各陽性試驗菌的回收率進行測定，結(jié)果見表1。

表1 薄膜過濾法沖洗量選擇回收率試驗結(jié)果

試驗結(jié)果:以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉作為試驗菌，對薄膜過濾后沖洗800 mL的方法進行了確認(rèn)試驗。結(jié)果試驗菌回收率金黃色葡萄球菌為82%，大腸埃希菌為88%，枯草芽孢桿菌79%，白色念珠菌80%，黑曲霉87%，回收率均大于70%，符合藥典相關(guān)要求。

2.3 控制菌檢查方法學(xué)考察

采用常規(guī)方法，直接將供試液10 mL加入100 mL增菌培養(yǎng)基中，以金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌作為陽性菌，大腸埃希菌為陰性對照菌，依法進行檢查。結(jié)果加入樣品后的金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均于48～72 h方可檢出，陽性對照菌于24 h生長良好，陰性對照菌未檢出大腸埃希菌，顯示樣品對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌有輕微的抑菌作用。

采用培養(yǎng)基稀釋法，每10 mL(1∶10)供試液加入不少于200 mL培養(yǎng)基中，金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均于24 h內(nèi)檢出，陽性對照菌于24 h生長良好，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌。因此，該方法能夠去除樣品中的抑菌物質(zhì)對控制菌檢查的影響。

2.4 方法確認(rèn)

由于各生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品處方工藝均存在一定的差別，故采用8個廠家各1批樣品對2.2項和2.3項下確定的方法進行了確認(rèn)，細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)采用將供試液薄膜過濾、沖洗800 mL的方法進行檢查。結(jié)果表2?？梢?，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均大于70%。

表2 各生產(chǎn)廠家產(chǎn)品細(xì)菌、霉菌和酵母菌回收率試驗結(jié)果(%)

控制菌檢查采用培養(yǎng)基稀釋法，每10 mL(1∶10)供試液加入不少于200 mL的增菌培養(yǎng)基中，結(jié)果8個生產(chǎn)廠家的樣品試驗組金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均于24 h內(nèi)檢出，陰性菌對照組均未長菌。

2.5 樣品微生物限度檢查方法

取本品10 g，加恒溫至45℃的pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，均勻分散后，制成1∶10的供試液。取1 mL供試液，薄膜過濾，再用800 mL pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液分次沖洗濾膜，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，進行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)計數(shù)檢查;另取10 mL供試液，加入不少于200 mL的亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基和膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法[1]進行金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的控制菌檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

3 討論

從各生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品所附藥品說明書處方來看，處方中除含具有抗真菌作用的主藥克霉唑外，還含有羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸鈉、醋酸氯己定等防腐劑，故該藥對細(xì)菌也具有一定的抑菌作用，與試驗結(jié)果相吻合。

由于乳膏劑呈黏稠狀態(tài)，即使分散后過濾也較困難，且克霉唑本身幾乎不溶于水。為此，曾嘗試采用無菌十四烷酸異丙酯分散后，再以氯化鈉－蛋白胨緩沖液萃取的方法除去脂溶性的抑菌成分，但該乳膏劑在十四烷酸異丙酯中不能很好分散，方法不可行。

雖然克霉唑本身幾乎不溶于水，但采用較好的分散劑分散，大量的氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗后，還是可將其殘留在薄膜上的抑菌成的除去，從而順利地進行微生物檢查。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄ⅪJ.