反相高效液相色譜法測(cè)定苯磺酸氨氯地平膠囊的含量和有關(guān)物質(zhì)

(重慶市第五人民醫(yī)院，重慶 400062)

苯磺酸氨氯地平是二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，主要用于治療高血壓和心絞痛，是理想的輕中度降血壓藥物[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)苯磺酸氨氯地平的含量測(cè)定方法報(bào)道較多，包括分光光度法[2－3]、熒光法[4]和高效液相色譜法[5－7]，但前兩種方法操作煩瑣、實(shí)驗(yàn)條件苛刻、價(jià)格昂貴;文獻(xiàn)[8－9]雖對(duì)苯磺酸氨氯地平及其片劑的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了檢查，但沒有對(duì)單一雜質(zhì)進(jìn)行限定，且國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[8]中采用高效液相色譜法測(cè)定含量，也無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。為保證用藥安全，筆者建立了苯磺酸氨氯地平膠囊的含量測(cè)定及其有關(guān)物質(zhì)檢查的反相高效液相色譜法，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津2010C型高效液相色譜儀;pHS－4型酸度計(jì)(杭州亞美電子儀器廠);賽多利斯BS224S型萬(wàn)分之一電子天平。苯磺酸氨氯地平對(duì)照品(批號(hào)為100374－200301，中國(guó)藥品生物制品檢定所);苯磺酸氨氯地平膠囊(規(guī)格為5 mg/片，批號(hào)為060701，060702，060910，南通華山藥業(yè)有限公司);乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Hypersil BDS 柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液(含0.7%三乙胺，磷酸調(diào) pH=4.0±0.1)－ 乙腈 (70 ∶30);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm;柱溫:30℃。理論板數(shù)按苯磺酸氨氯地平峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。苯磺酸氨氯地平峰和相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液配制

稱取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品20.0 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，置4℃冰箱保存，1個(gè)月內(nèi)使用。

2.2.2 測(cè)定方法

取本品20粒，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于苯磺酸氨氯地平5 mg)，置250 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液;另取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成1 mL含苯磺酸氨氯地平20 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取供試品和對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中苯磺酸氨氯地平的含量。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察:吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和空白輔料溶液，依法進(jìn)樣。色譜圖見圖1，可見流動(dòng)相、輔料對(duì)苯磺酸氨氯地平含量測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 含量測(cè)定高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品貯備液適量，制成質(zhì)量濃度分別為 5.0，10.0，20.0，40.0，50.0 μg/mL 的溶液，分別精密吸取10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積 (Y)對(duì)苯磺酸氨氯地平質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 Y=43 089X－8 418.6，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明，苯磺酸氨氯地平質(zhì)量濃度在5.0～50.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密量取對(duì)照品貯備液適量，用流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為 10.0，20.0，40.0 μg/mL 的溶液，依法測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD 分別為 0.62% ，0.26% ，0.44%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):室溫下，取同一供試品溶液，于 0，2，4，6，8 h 時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果苯磺酸氨氯地平含量的 RSD為0.76%(n=5)，表明室溫下供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn):于空白輔料中，按處方量加入苯磺酸氨氯地平對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制成低、中、高3種質(zhì)量濃度(16.0，20.0，24.0 μg/mL)的溶液，依法測(cè)定，結(jié)果平均回收率分別為99.17%，100.03% ，99.85%，RSD 分別為 1.21%，0.87%，1.06%(n=3)。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，照2.2.2項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 3批樣品含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果(n=3)

2.3 有關(guān)物質(zhì)檢查

2.3.1 測(cè)定方法

取本品20粒，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于苯磺酸氨氯地平15 mg)，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液;精密量取供試品溶液適量，加流動(dòng)相稀釋成每1 mL中含苯磺酸氨氯地平3 μg的溶液，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液10 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰高約為滿量程的10% ～20%;再取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中，如顯示雜質(zhì)峰，除溶劑峰外，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液色譜主峰面積(1.0%)，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液色譜主峰面積的1.5倍(1.5%)。

2.3.2 破壞試驗(yàn)

精密稱取本品內(nèi)容物適量(約相當(dāng)于苯磺酸氨氯地平15 mg)，加20 mL 0.1 mol/mL鹽酸溶解，室溫放置2 h后，用0.1 mol/mL氫氧化鈉中和至中性(酸破壞);精密稱取本品內(nèi)容物適量(約相當(dāng)于苯磺酸氨氯地平 15 mg)，加20 mL 0.1 mol/mL氫氧化鈉溶解，室溫放置2 h后，用0.1 mol/mL鹽酸中和至中性(堿破壞);取本品20粒，在60℃時(shí)加熱5 d(高溫破壞);取本品20粒，相對(duì)濕度75%的條件下放置5 d(高濕破壞);取本品20粒，在強(qiáng)光(照度為 4 500±500 lx)下，照射3 d(強(qiáng)光破壞)。取以上各破壞試驗(yàn)樣品，按2.3.1項(xiàng)下方法測(cè)定。色譜圖見圖2?？梢?，該方法能有效檢測(cè)出各種破壞產(chǎn)生的降解物，且各雜質(zhì)峰間及雜質(zhì)峰與主峰間均能達(dá)到基線分離，所建立的方法對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查的專屬性較好。

2.3.3 檢測(cè)限確定

稱取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品適量，精密稱定用流動(dòng)相制成每1 mL 中含 0.3 μg 的溶液，精密吸取 5 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果信噪比約等于3時(shí)，最低檢測(cè)限為1.5 ng。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.3.1項(xiàng)下方法平行制備每1 mL中含0.3 mg的供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，以雜質(zhì)含量進(jìn)行方法精密度考察。結(jié)果單一最大雜質(zhì)的 RSD為0.97%，總雜質(zhì)的 RSD為1.06%(n=6)。

2.3.5 樣品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

采用2.3.1項(xiàng)下方法，對(duì)3批樣品進(jìn)行檢查。結(jié)果見表1。

圖2 破壞性試驗(yàn)色譜圖

3 討論

苯磺酸氨氯地平化學(xué)名為3－乙基－5－甲基－2－(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)－1，4－二氫－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯苯磺酸鹽，對(duì)光比較敏感，主要雜質(zhì)包括3－乙基－5－甲基－4－(2－氯苯基)－2－[[2－(1，3－二氧代 －1，3－二氫 －2 H－異吲哚－2－氨基)乙氧基?甲基]－1，4－二氫－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯;3－乙基－5－甲基－4－(2－氯苯基)－1，4－二氫－6－甲基－2－[[2－[[2－(甲基氨甲?；?苯甲?；鵠氨基]乙氧基]甲基]－3，5－吡啶二羧酸酯;乙基甲基－2，6－雙[(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)1，4－二氫－3，5－吡啶二羧酸酯;3－乙基－5－甲基－2－(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯。目前國(guó)內(nèi)已發(fā)表文獻(xiàn)尚未對(duì)單一雜質(zhì)進(jìn)行限定。由穩(wěn)定性試驗(yàn)和破壞試驗(yàn)可知，氨氯地平峰前一雜質(zhì)會(huì)明顯增加，而且歐洲藥典對(duì)雜質(zhì)3－乙基－5－甲基－2－(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯進(jìn)行了限定。筆者結(jié)合國(guó)內(nèi)氨氯地平原料藥及膠囊生產(chǎn)工藝情況，對(duì)苯磺酸氨氯地平膠囊的總雜質(zhì)和單一最大雜質(zhì)進(jìn)行了限定。

在篩選流動(dòng)相條件時(shí)，流動(dòng)相強(qiáng)度對(duì)雜質(zhì)檢出的影響較大。當(dāng)流動(dòng)相強(qiáng)度為 0.7%三乙胺溶液(磷酸調(diào) pH=3.0±0.1)－乙腈(70∶30)時(shí)，能檢測(cè)到較多的雜質(zhì)峰且主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離較好;三乙胺的濃度影響峰保留時(shí)間、峰形及分離度，三乙胺濃度低時(shí)保留時(shí)間延后、峰展寬，流動(dòng)相的三乙胺濃度為0.7%時(shí)峰形較好，主峰保留時(shí)間較合適，且主峰與相鄰雜質(zhì)峰能達(dá)到完全分離;鹽濃度和pH對(duì)本品的保留時(shí)間及峰形影響不大。因此，最終確定0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液(含0.7%三乙胺，磷酸調(diào) pH=4.0±0.1)－乙腈 (70∶30)為本品有關(guān)物質(zhì)檢查的流動(dòng)相。

精密稱取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品適量，制成含苯磺酸氨氯地平10.0 μg/mL的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果苯磺酸氨氯地平在237 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且空白輔料的流動(dòng)相溶液在237 nm波長(zhǎng)處基本無(wú)吸收，不干擾樣品測(cè)定，故檢測(cè)波長(zhǎng)選定為237 nm。

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