不同方式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠破骨細(xì)胞分化及相關(guān)調(diào)節(jié)因子的影響

李世昌，季 瀏，馬 濤，羅 劍，李珍惜，鄭慶云

前言

骨組織的正常生長(zhǎng)及更新有賴于骨吸收與骨形成的動(dòng)態(tài)平衡。由破骨細(xì)胞作用的骨吸收是骨重建的起點(diǎn)，它可以清除損傷或沒(méi)有承載功能的骨組織，繼而啟動(dòng)由成骨細(xì)胞作用的骨形成過(guò)程，使骨組織始終處在不斷的動(dòng)態(tài)更新過(guò)程中。在某些狀態(tài)下，破骨細(xì)胞數(shù)量異常及功能紊亂，則發(fā)生骨量過(guò)分減少的疾病，如骨吸收功能亢進(jìn)的骨質(zhì)疏松癥等。婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥就是由于絕經(jīng)后雌激素的迅速下降引起的破骨細(xì)胞大量生成及活化導(dǎo)致的。

在影響破骨細(xì)胞數(shù)量及活性的眾多因素中，骨組織及骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞因子越來(lái)越多地受到研究者的關(guān)注，其中，骨保護(hù)素（osteop rotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)和核因子κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB， RANK)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族中的3個(gè)新成員，也是破骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子，主要存在于人的骨髓及其他部分組織中。在2000年美國(guó)骨與礦物質(zhì)研究協(xié)會(huì)對(duì)它們進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化命名，并統(tǒng)稱為OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)。成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的 M-CSF和RANKL，在M-CSF存在的條件下，RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合后，可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和激活，并抑制破骨細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)骨吸收。同時(shí)，成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的OPG一方面，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，另一方面，可與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK，抑制破骨細(xì)胞生成、成熟、終止骨吸收，并通過(guò)臨近接觸的成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成[20]。M-CSF主要由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，也可由成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。M-CSF一方面，可以促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞/破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，另一方面，它通過(guò)與破骨細(xì)胞前體上的M-CSF受體結(jié)合發(fā)揮作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[10]。OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)和破骨細(xì)胞的形成與活化密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，許多激素、細(xì)胞因子等均通過(guò)直接或間接的調(diào)節(jié)OPG、RANKL和RANK的表達(dá)來(lái)影響骨代謝[1]。

近年來(lái)，有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)絕經(jīng)期婦女骨骼影響的研究逐漸增多，動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均表明，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)可以減緩絕經(jīng)期婦女的骨質(zhì)流失，從而有效的預(yù)防骨質(zhì)疏松[7，9]。然而運(yùn)動(dòng)類(lèi)型多種多樣，不同類(lèi)型的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷不同，對(duì)骨的影響也不一樣。Rubin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給6～8歲Warhill母羊后腿施加低強(qiáng)度、高頻（30 Hz)機(jī)械刺激（與地面垂直的振動(dòng))，每天刺激20 min，5天/周，共1年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，接受機(jī)械刺激的羊近端股骨的骨小梁密度增加了34.2％（P＜0.01)。此外，經(jīng)未脫鈣骨的組織學(xué)檢查顯示，骨小梁體積增加了32％，骨小梁網(wǎng)格數(shù)增加了45％，網(wǎng)格間距減小了36％。這提示每個(gè)骨小梁?jiǎn)卧钠骄鶎挾仍黾?，并形成了新的骨小梁。Rubin認(rèn)為，生物力學(xué)干預(yù)有助于加強(qiáng)骨質(zhì)。Borer等[12]研究發(fā)現(xiàn)，-9°下坡運(yùn)動(dòng)組的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度雖只有45％˙VO2max，明顯低于6°上坡運(yùn)動(dòng)組（75％˙VO2max)，但利用足底壓力感受儀進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，-9°下坡運(yùn)動(dòng)組相對(duì)于6°運(yùn)動(dòng)組能產(chǎn)生更大的足底壓力，兩組之間有顯著差異，而且比較成骨指數(shù)（I型膠原羧基端前肽/I型膠原羧基末端肽的比值)， -9°下坡運(yùn)動(dòng)組與6°上坡運(yùn)動(dòng)組和安靜對(duì)照組之間有顯著差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，成骨指數(shù)與足底壓力之間存在顯著相關(guān)性。因此，通過(guò)對(duì)比研究不同的運(yùn)動(dòng)方式對(duì)骨組織的影響，并以此為依據(jù)制定出科學(xué)的健骨運(yùn)動(dòng)方案就顯得尤為迫切。

目前，有關(guān)運(yùn)動(dòng)與骨健康關(guān)系的研究大多數(shù)只是停留在骨量、骨結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)指標(biāo)以及骨代謝生化指標(biāo)上，在運(yùn)動(dòng)對(duì)骨組織影響的細(xì)胞及分子機(jī)制研究則很少涉及，而有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)于破骨細(xì)胞影響的研究則更少報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)外僅有的運(yùn)動(dòng)對(duì)破骨細(xì)胞影響的研究，只是通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞施加各種力學(xué)刺激來(lái)推測(cè)運(yùn)動(dòng)對(duì)破骨細(xì)胞的影響[16，17]，這與真實(shí)的體育運(yùn)動(dòng)對(duì)體內(nèi)環(huán)境破骨細(xì)胞的影響仍有很大的差異。

本研究以去卵巢小鼠模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥狀，利用破骨細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)，研究在去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生過(guò)程中破骨細(xì)胞分化的情況，并研究在其發(fā)生過(guò)程中與破骨細(xì)胞分化密切相關(guān)的骨組織及骨髓微環(huán)境中RANKL、OPG、M-CSF和RANK等因子的基因表達(dá)的變化；同時(shí)，比較研究上、下坡跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)上述指標(biāo)的影響。這對(duì)于深入揭示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制及運(yùn)動(dòng)干預(yù)措施的選擇將具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí) C57 BL/6雌性小鼠 64只，約 8周齡，體重21.08±3.89 g（由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)。動(dòng)物購(gòu)回后在本實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)安靜組（SHAM)，去卵巢安靜組（OVX)，去卵巢上坡跑組（OVX+UP)，去卵巢下坡跑組（OVX+DOWN)，每組16只。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基、紅細(xì)胞裂解液、Versene、SRB染料、TCA固定液、Tris、Citrate Solution、Acid Phosphatase，Leukocyte（TRAP)Kit購(gòu)自 Sigma公司；刺激因子 M-CSF和RANKL購(gòu)自R＆D公司；總RNA提取試劑 Trizol購(gòu)自Invitrogen；氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇、DEPC水、戊巴比妥鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Agarose、Goldview染料購(gòu)自 GENE company LTD；Gene ruler、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq、RNase Inhibitor購(gòu)自 TaKaRa。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自KUBOTA；酶標(biāo)儀購(gòu)自Tecan；Leica DM 4000電子顯微鏡購(gòu)自Leica；二氧化碳培養(yǎng)箱、NANODROP 2000 spectrophotometer購(gòu)自 Thermo；電泳槽、電泳儀、普通PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自 Tanon；Applied Biosystem Step One Real-time PCR儀購(gòu)自ABI；EW-6000微型離心機(jī)購(gòu)自 EastWin；96孔板、12孔板、6孔板購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 去卵巢手術(shù)

動(dòng)物以1％戊巴比妥鈉（0.1 g/kg)經(jīng)腹腔麻醉后，剪除長(zhǎng)毛，分別在脊柱兩側(cè)切開(kāi)背肌1 cm切口，SHAM組小鼠行去卵巢假手術(shù)，僅去除卵巢周?chē)倭恐窘M織，其余3組小鼠均摘除卵巢，用可吸收的羊腸線縫合傷口，在傷口外涂少量紅霉素軟膏。

1.4 運(yùn)動(dòng)方案

SHAM組和OVX組在籠中正常飼養(yǎng)，沒(méi)有進(jìn)行任何訓(xùn)練；OVX+UP組和OVX+DOWN組于去卵巢手術(shù)后7天開(kāi)始進(jìn)行上坡跑或下坡跑訓(xùn)練，訓(xùn)練方案見(jiàn)表1。

表1 運(yùn)動(dòng)組小鼠訓(xùn)練方案一覽表

1.5 破骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及檢測(cè)

于運(yùn)動(dòng)組小鼠最后一次訓(xùn)練結(jié)束后24 h，斷頸椎處死小鼠。取出兩側(cè)股骨、脛骨和肱骨，放入 PBS中。用剪刀剪除股骨、脛骨和肱骨兩端的關(guān)節(jié)。用2～3 mlα-MEM培養(yǎng)基、10 ml注射器和27G針頭沖洗出骨髓。將骨髓收集在50 m l離心管里，1 000 rpm離心5 min，骨髓細(xì)胞集中于離心管底部，以5 ml不完全α-MEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。加入20 m l紅細(xì)胞裂解液，上下顛倒若干次，在室溫下孵育細(xì)胞1～2 min。加入25 ml完全α-M EM培養(yǎng)基（含10％血清)，1 200 rpm離心5 min。用完全α-M EM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，加入5 ng/ml的M-CSF，在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜。收集上層漂浮的骨髓干細(xì)胞（造血干細(xì)胞)，加入10 ng/m l的M-CSF，在10 cm培養(yǎng)皿中孵育2天，干細(xì)胞布滿整個(gè)培養(yǎng)皿。用 PBS沖洗細(xì)胞 2次，加入 3 mlVersene， 37℃孵育10 min，收集干細(xì)胞，用5 mlα-M EM培養(yǎng)基中和，離心后用3 m l完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。把收集到的干細(xì)胞分成以下兩份分別對(duì)骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的能力以及巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的能力進(jìn)行檢測(cè)。

1.將干細(xì)胞接種于96孔板，密度為每孔10 000個(gè)細(xì)胞，加入10 ng/m l的M-CSF培養(yǎng)5天，干細(xì)胞將逐漸分化為巨噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞在M-CSF和RANKL的作用下可繼續(xù)向破骨細(xì)胞前體分化，最終可分化為破骨細(xì)胞)，分別在第1、3、5天進(jìn)行SRB染色，繪制骨髓干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以檢測(cè)骨髓干細(xì)胞生長(zhǎng)情況。SRB染色具體步驟為：加入25 m l預(yù)冷的 TCA固定液，4℃過(guò)夜，倒掉 TCA固定液，流水沖洗5遍，風(fēng)干，加入30μl SRB染料，室溫放置10 min，吸取SRB染料，用1％冰乙酸洗5遍，風(fēng)干，加入100μl 10 mM的 Tris，溶解燃料，輕輕混勻，酶標(biāo)儀515 nm處測(cè)OD值。

2.將干細(xì)胞接種于96孔板，密度為每孔8 000個(gè)細(xì)胞，加入10 ng/ml的M-CSF和50 ng/ml的RANKL培養(yǎng)5天，隔天換液，干細(xì)胞將依次分化為巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體、破骨細(xì)胞，5天后進(jìn)行破骨細(xì)胞 TRAP染色，以檢測(cè)破骨細(xì)胞的分化情況。破骨細(xì)胞 TRAP染色具體步驟為：配制 TRAP染色固定液和染液，吸去96孔板中的培養(yǎng)基，加入固定液，室溫固定30 s，用雙蒸水洗3次，加入染液， 37℃搖床30 min，用雙蒸水洗3次，Leica DM 4000電子顯微鏡拍照。

1.6 Real time PCR法測(cè)定骨組織 RANKL、OPG、M-CSF和RANK的基因表達(dá)

常規(guī)方法提取股骨總RNA，逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)所要檢測(cè)的目的基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢各基因引物序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成，各基因引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度為：

RANKL：F 5′-CTCACCTCACCATCAATGCTGC-3′， R 5′

-GAAGGGTTGGACACCTGGACGC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度394 bp；

OPG：F 5′-TCCTGGCACCTACCTAAAACAGCA-3′， R 5′

-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度578 bp；

M-CSF：F 5′-CTGGCGAGCAGGAGTATCAC-3′，

R 5′-TCAGAGTCCTCCCAGGTCAA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度606 bp；

RANK：F 5′-CTGCTCCTCTTCATCTCTGTG-3′，

R 5′-CTTCTGGAACCATCTTCTCCTC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度316 bp；

β-actin：F 5′-CAATTCCATCATGAAGTGTGAC-3′，

R 5′-CCACACAGAGTACTTGCGCTC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度184bp。

熒光定量 PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照以下體系進(jìn)行，SYBR Premix Ex Taq TM（2×)10μl、PCR Forward Primer（10 μM)0.4μl、PCR Reverse Primer（10μM)0.4μl、ROX Reference Dye（50×)0.4μl、DNA模板2μl、加 DEPC水使總反應(yīng)體系達(dá)到20μl。Real time PCR分三階段，擴(kuò)增采用三步法進(jìn)行，溫度循環(huán)參數(shù)如下：Stage 1（1×)：95℃，1 min（預(yù)變性)。Stage 2（40×)：95℃，15 s；61℃，30s； 72℃，45 s（收集熒光)。Stage3（1×)：建立 PCR產(chǎn)物的熔解曲線，95℃，30 s；61℃，2 min；95℃，15 s；每1℃收集熒光。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2-ΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組小鼠骨髓干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

向骨髓干細(xì)胞中加入10 ng/ml的M-CSF后，干細(xì)胞將逐漸分化為巨噬細(xì)胞，如圖1所示，在加入M-CSF后，各組小鼠骨髓干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的速度不同：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第3天時(shí)，OVX組干細(xì)胞分化數(shù)量已明顯大于SHAM組，而且具有非常顯著性差異（P＜0.01)，兩運(yùn)動(dòng)組干細(xì)胞分化數(shù)量明顯小于OVX組（P＜0.05)，但仍大于SHAM組（P＜0.05)，兩運(yùn)動(dòng)組之間的干細(xì)胞分化速度沒(méi)有顯著性差異；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)，OVX組干細(xì)胞分化數(shù)量仍然明顯大于SHAM組，而且具有非常顯著性差異（P＜0.01)，兩運(yùn)動(dòng)組干細(xì)胞分化數(shù)量明顯小于OVX組（P＜0.01)，但仍大于 SHAM組（P＜0.01)，而兩運(yùn)動(dòng)組之間相比，OVX+DOWN組比OVX+UP組干細(xì)胞分化數(shù)量顯著減少（P＜0.05)。

圖1 各組小鼠骨髓干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖

2.2 不同方式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠破骨細(xì)胞分化的影響

圖2為破骨細(xì)胞 TRAP染色結(jié)果，從圖中可以看出，破骨細(xì)胞是一種空泡狀、類(lèi)似巨噬細(xì)胞的細(xì)胞。在空泡狀的破骨細(xì)胞中顏色較深處為破骨細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞核聚集的部位。破骨細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞核聚集在一起并極化到破骨細(xì)胞的一側(cè)，而不是在中央位置，而正是由于破骨細(xì)胞的這種空泡狀和極化的結(jié)構(gòu)為其發(fā)揮骨吸收的功能奠定了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。在本研究中，向骨髓干細(xì)胞中加入10 ng/ m l的M-CSF和50 ng/m l的RANKL繼續(xù)培養(yǎng)，干細(xì)胞將依次分化為巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體、破骨細(xì)胞。如圖2和圖3所示，在加入M-CSF和RANKL 5天后進(jìn)行TRAP染色并對(duì)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，各組小鼠骨髓干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的速度明顯不同：OVX組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯大于SHAM組（P＜0.01)；兩運(yùn)動(dòng)組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯小于OVX組（P＜0.05)，但仍大于 SHAM組（P＜0. 05)；兩運(yùn)動(dòng)組之間相比，OVX+DOWN組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯小于OVX+UP組（P＜0.05)。

圖2 各組小鼠破骨細(xì)胞分化的形態(tài)圖（×400倍)

圖3 各組小鼠破骨細(xì)胞分化的計(jì)數(shù)圖

2.3 OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)各因子mRNA相對(duì)表達(dá)量

OVX組與SHAM組相比較，則OVX組比SHAM組RANKL、M-CSF和RANK mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01)；而OPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.01)。兩運(yùn)動(dòng)組與OVX組相比較，則OVX+UP組比OVX組的RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著性降低（P＜ 0.01)，而OPG相對(duì)表達(dá)量顯著性升高（P＜0.05)，OVX+ UP組與OVX組的M-CSF和RANK mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05和P＞0.05)；OVX+DOWN組比OVX組的RANKL和M-CSFmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著性降低（P＜0.01和P＜0.05)，而OPG相對(duì)表達(dá)量顯著性升高（P＜0.01)，OVX+DOWN組與OVX組的RANK mRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05)。兩運(yùn)動(dòng)組之間相比較，則OVX+DOWN組比OVX+UP組的RANKL和M-CSFmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05和P＜0.05)，而 OPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜ 0.01)，兩運(yùn)動(dòng)組之間的RANK mRNA的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05)（圖4)。

圖4 OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)各因子m RNA相對(duì)表達(dá)量示意圖

3 分析與討論

3.1 不同方式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠骨髓干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF)主要由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，也可由成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，它既是破骨細(xì)胞分化早期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是破骨細(xì)胞增殖分化的必要條件[10]。M-CSF通過(guò)與破骨細(xì)胞前體上的M-CSF受體（c-fms)結(jié)合發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏M-CSF的大鼠由于缺少破骨細(xì)胞出現(xiàn)骨骼硬化癥；而過(guò)度表達(dá)M-CSF的基因改造鼠則由于破骨細(xì)胞數(shù)目增多，出現(xiàn)嚴(yán)重的骨量減少[15]。破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，在M-CSF和核因子κB受體活化因子配體（RANKL)等細(xì)胞因子的刺激下，造血干細(xì)胞可向巨噬細(xì)胞分化、融合并最終形成破骨細(xì)胞[19]。本研究向含有骨髓干細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入M-CSF進(jìn)行刺激，培養(yǎng)過(guò)夜后，上層漂浮的骨髓干細(xì)胞即為造血干細(xì)胞，而下層的貼壁細(xì)胞主要是骨髓基質(zhì)細(xì)胞（在某些刺激條件下可分化為成骨細(xì)胞)。對(duì)收集到的造血干細(xì)胞繼續(xù)加入M-CSF進(jìn)行刺激，造血干細(xì)胞將逐漸分化為巨噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞在 M-CSF和RANKL的作用下可繼續(xù)向破骨細(xì)胞前體分化，最終可分化為破骨細(xì)胞)[22]。通過(guò)SRB染色，檢測(cè)造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的不同時(shí)段的光密度，就可以了解各組小鼠骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的能力，并預(yù)示著進(jìn)一步向破骨細(xì)胞分化的能力。

本研究的結(jié)果顯示，OVX組骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的數(shù)量明顯大于SHAM組，這說(shuō)明小鼠去卵巢手術(shù)后，由于雌激素的迅速下降，導(dǎo)致骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞大量分化，這是破骨細(xì)胞大量形成和發(fā)揮骨吸收作用的前提條件，大大增加了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病幾率；而兩運(yùn)動(dòng)組骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的數(shù)量明顯小于OVX組，但仍大于SHAM組，說(shuō)明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以有效地抑制小鼠去卵巢后骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的能力，對(duì)于雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥可以起到有效的預(yù)防作用，但仍不能達(dá)到正常水平；兩運(yùn)動(dòng)組之間相比，OVX+ DOWN組比OVX+UP組骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的數(shù)量明顯減少，說(shuō)明在預(yù)防雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥方面，下坡跑運(yùn)動(dòng)比上坡跑運(yùn)動(dòng)更有效。

3.2 不同方式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠破骨細(xì)胞分化的影響

破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，其具體分化過(guò)程為：造血干細(xì)胞在M-CSF的作用下，可分化為巨噬細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞在M-CSF和RANKL的共同作用下可分化為破骨細(xì)胞前體并繼而分化為破骨細(xì)胞（圖5)[13]。

本研究將各組小鼠造血干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在M-CSF和RANKL的共同刺激下，造血干細(xì)胞將逐漸分化為破骨細(xì)胞，5天后進(jìn)行破骨細(xì)胞 TRAP染色，對(duì)各組破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，就可以檢測(cè)各組小鼠造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的能力。本研究結(jié)果表明，去卵巢手術(shù)組由于雌激素的迅速下降，使骨髓造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的能力大大增加，破骨細(xì)胞形成增多，預(yù)示著發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)性大大增加；而跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以有效地抑制去卵巢手術(shù)所引起的造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化能力的增強(qiáng)，對(duì)雌激素缺乏引起的破骨細(xì)胞大量分化起到有效的抑制作用，大大降低了發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)性，且下坡跑運(yùn)動(dòng)的效果優(yōu)于上坡跑運(yùn)動(dòng)。

3.3 不同方式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠骨組織 OPGRANKL-RANK系統(tǒng)的影響

OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能發(fā)揮的一個(gè)重要信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)，許多激素和細(xì)胞因子都是通過(guò)影響這條通路，從而間接的參與調(diào)節(jié)骨代謝的。此外，OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)還是聯(lián)系成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間通訊的重要紐帶，成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)OPG和RANKL，RANKL可與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和激活，并抑制破骨細(xì)胞的凋亡；而OPG一方面，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，另一方面，可與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK，抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收，并通過(guò)臨近接觸的成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成[18]。許多激素和細(xì)胞因子正是通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞RANKL和OPG的分泌，從而參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和功能發(fā)揮的。M-CSF在破骨細(xì)胞的分化和骨吸收的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，骨髓造血干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞/破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化需有M-CSF的存在，同時(shí)， RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合也離不開(kāi)M-CSF的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏M-CSF的大鼠由于缺少破骨細(xì)胞出現(xiàn)骨骼硬化癥；而過(guò)度表達(dá)MCSF的基因改造鼠則由于破骨細(xì)胞數(shù)目增多出現(xiàn)嚴(yán)重的骨量減少[15]。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)于骨代謝的影響，主要是通過(guò)骨組織受到的應(yīng)力、激素的分泌、運(yùn)動(dòng)造成營(yíng)養(yǎng)吸收的改變等方面來(lái)發(fā)揮作用的，其中骨組織在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中受到的應(yīng)力對(duì)骨代謝的影響作用最明顯[5，23]。骨組織在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中受到地面的反作用力以及骨骼肌施加的各種應(yīng)力，骨細(xì)胞感受到這種應(yīng)力，通過(guò)機(jī)械―化學(xué)偶聯(lián)將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)信號(hào)來(lái)發(fā)揮作用。遍布于整個(gè)骨陷窩—骨小管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的骨細(xì)胞是骨的初級(jí)機(jī)械感應(yīng)細(xì)胞，骨細(xì)胞通過(guò)間隙連接與骨表面細(xì)胞和臨近骨細(xì)胞保持信息聯(lián)系，他們對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)是加快代謝、激活基因和產(chǎn)生生長(zhǎng)因子和基質(zhì)等[6，8]。機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)是多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同結(jié)果，可導(dǎo)致骨細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架水平被激活[11]，如切應(yīng)力激活 G蛋白偶聯(lián)的機(jī)械刺激感受器，可引起胞內(nèi)鈣、前列腺素（Prostaglandin，PG)和一氧化氮水平的提高。一氧化氮和前列腺素 E2（Prostaglandin E2，PGE2)作為中間信號(hào)，參與將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)過(guò)程，引起機(jī)體多種激素和細(xì)胞因子發(fā)生變化，這些激素和細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)并構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，最終直接或間接地通過(guò)OPGRANKL-RANK系統(tǒng)調(diào)控骨代謝[3]。在 Kobayashi Y等人[14]的活體實(shí)驗(yàn)中，利用正畸矯正器對(duì)大鼠上頜磨牙施加應(yīng)力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)力導(dǎo)致骨吸收向骨形成的轉(zhuǎn)換，使破骨細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，同時(shí)原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示，在應(yīng)力末端的骨表面OPGm RNA的表達(dá)增加。

本研究的結(jié)果表明，與OVX組相比，OVX+UP組比OVX組RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著性降低，而OPG相對(duì)表達(dá)量顯著性升高；OVX+DOWN組比OVX組RANKL和M-CSFmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著性降低，而OPG相對(duì)表達(dá)量顯著性升高。這表明，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)骨組織起到了較好的刺激作用，骨組織在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中受到了較理想的應(yīng)力，通過(guò)機(jī)械—化學(xué)偶聯(lián)將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)信號(hào)，使骨組織局部RANKL和M-CSF基因表達(dá)降低，而OPG基因表達(dá)升高，從而改善了雌激素缺乏導(dǎo)致的骨代謝失衡，部分阻止了骨量的下降。兩運(yùn)動(dòng)組之間相比較，則OVX+DOWN組比OVX+UP組RANKL和M-CSF mRNA基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而OPG基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。表明在改善雌激素缺乏引起的骨代謝失衡方面，下坡跑運(yùn)動(dòng)比上坡跑運(yùn)動(dòng)的效果更顯著。另外，兩跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組與OVX組之間以及兩跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組之間的RANK基因的相對(duì)表達(dá)量均沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)骨組織RANK基因的表達(dá)沒(méi)有顯著性影響，RANK基因表達(dá)量變化可能不是一個(gè)限制因素；運(yùn)動(dòng)對(duì)于骨組織OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的影響主要是通過(guò)改變OPG、RANKL和M-CSF等因子的基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

3.4 不同方式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠破骨細(xì)胞分化影響的對(duì)比分析

通過(guò)對(duì)比上坡跑運(yùn)動(dòng)與下坡跑運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠破骨細(xì)胞分化及OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的影響，本研究發(fā)現(xiàn)，上、下坡跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢引起的破骨細(xì)胞的分化具有較好的抑制作用，且下坡跑運(yùn)動(dòng)比上坡跑運(yùn)動(dòng)具有更好的效果，究其原因，主要是上坡跑運(yùn)動(dòng)和下坡跑運(yùn)動(dòng)在運(yùn)動(dòng)時(shí)對(duì)于骨的力學(xué)刺激不同。下坡跑運(yùn)動(dòng)每一步跑動(dòng)在下落過(guò)程中所克服的垂直方向的沖量比上坡跑運(yùn)動(dòng)大，其骨組織所受到的地面應(yīng)力也比上坡跑運(yùn)動(dòng)大。此數(shù)據(jù)結(jié)果與原因分析在本實(shí)驗(yàn)室前期已發(fā)表論文中已有闡述[3]，這里就不再詳細(xì)展開(kāi)。另外，此結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)室前期有關(guān)縱跳運(yùn)動(dòng)對(duì)于骨密度影響的研究結(jié)果相吻合[2，4]。

4 結(jié)論

1.跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)改變骨組織OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關(guān)因子的基因表達(dá)，可有效抑制小鼠去卵巢后破骨細(xì)胞的大量分化，從而有利于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

2.下坡跑運(yùn)動(dòng)比上坡跑運(yùn)動(dòng)對(duì)于小鼠去卵巢后破骨細(xì)胞分化的抑制作用更有效，這主要是由于兩種運(yùn)動(dòng)方式在運(yùn)動(dòng)中骨組織所受到的應(yīng)力不同所致。

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