mdr1及P-gp與腦膠質(zhì)瘤耐藥關(guān)系的研究

付旭東 張艷艷 王新軍 壽記新 宋來君

惡性膠質(zhì)瘤患者平均生存期較短，通常手術(shù)切除腫瘤組織并不能從根本上延長患者的生存時間，而且應(yīng)用藥物化療易產(chǎn)生多藥耐藥性（multidrug resistance,MDR），使化療失敗。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）介導的藥物外排是產(chǎn)生MDR的主要機制，其編碼基因分別為mdr1和mrp1。本研究以耐阿霉素(Dox)的人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251為研究對象，觀察mdr1對腦膠質(zhì)瘤細胞MDR形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251購自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司。參考劉福生等[1]的方法，本實驗室利用Dox自行誘導U251耐藥細胞（U251/Dox），取對數(shù)生長期U251細胞在37℃，飽和濕度及5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)于低濃度Dox（0.001、0.01、0.1、0.25、0.5 mg/L，4周內(nèi)提高藥物濃度），在細胞傳代過程中相互結(jié)合，4個月后將細胞培養(yǎng)于含0.5 mg/LDox和10%FBS的1640培養(yǎng)液中，3～4 d傳一代；在無Dox的細胞培養(yǎng)液中耐藥性不變，說明已有穩(wěn)定的耐藥性。實驗時取對數(shù)生長期細胞。Rh123（美國Sigma公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），RT-PCR兩步法試劑盒（TaKaRa公司），引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，免疫組化SP試劑盒及兔抗人P-gp單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 流式細胞術(shù)檢測Rh123蓄積與泵出試驗 Rh123蓄積試驗：取對數(shù)生長期U251和U251/Dox細胞，稀釋到1×106個/ mL，接種于6孔板，3個復(fù)孔，Rh123終濃度1 mg/L，37℃，5% CO2孵育60 min，冷PBS洗2次，立即檢測細胞的平均熒光強度(MFI)。Rh123泵出試驗：細胞收集處理方法同上；37℃，5%CO2孵育60 min，冷PBS洗2次，然后檢測MFI(0 min泵出)；余液同時置于PBS溶液中，于60 min后，冷PBS洗2次并檢測MFI(60 min泵出)。Rh123細胞泵出率=（1-60 min MFI/ 0 min MFI）×100%。

1.3 U251及U251/Dox細胞mdr1 mRNA表達 取對數(shù)生長期的U251及U251/Dox細胞，總RNA提取和RT-PCR按Trizol和TaKaRa試劑盒操作。引物：β-actin上游5′-ATA TCG CTG CGC TGG TCG TC-3′，下游5′-AGG ATG GCG TGA GGG AGA GC-3′，產(chǎn)物517 bp；mdr1上游5′-CCA TCA TTG C AA TAG CAG G-3′，下游5′-AGT CCT CGT CTT CAA ACT TG-3′，產(chǎn)物157 bp。PCR循環(huán)為94℃預(yù)變性1 min，然后30 s，55℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物分析采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，BIORAD Quantity One 4.2凝膠圖像分析系統(tǒng)。計算方法：目的基因條帶灰度相對值=（目的基因條帶灰度值-背景灰度值)/(內(nèi)參基因條帶灰度值-背景灰度值）。

1.4 P-gp表達 采用免疫組織化學法，細胞培養(yǎng)片經(jīng)4%多聚甲醛固定，加入兔抗人P-gp單克隆抗體(1∶300)。判斷標準：細胞漿及細胞膜上有棕黃色顆粒的為陽性細胞。每例均隨機觀察8個高倍視野，讀取陽性細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 U251、U251/Dox細胞對Rh123蓄積與泵出能力 Rh123的蓄積試驗顯示，60 min時，U251細胞較U251/Dox細胞內(nèi)藥物蓄積顯著增加(MFI分別為375.31±13.53和168.00±18.03，t=15.93，P＜0.05)。U251/Dox細胞內(nèi)藥物泵出率高，細胞內(nèi)藥物明顯減少，見表1。

表1 U251、U251/Dox細胞對Rh123泵出能力(n=6，±s)

表1 U251、U251/Dox細胞對Rh123泵出能力(n=6，±s)

＊P＜0.05

組別MFI 0 min 60 min泵出率（%）U251 U251/Dox t 16.67±1.53 51.00±3.61 15.19＊216.56±1.44 197.44±7.48 4.35＊180.26±4.67 96.79±10.04 13.06＊

2.2 mdr1 mRNA的表達水平 U251/Dox細胞mdr1電泳條帶較亮、產(chǎn)量高，其灰度值較U251細胞灰度值增高，見表2。

表2 mdr1 mRNA及P-gp表達情況（n=6，±s）

表2 mdr1 mRNA及P-gp表達情況（n=6，±s）

＊P＜0.05

組別 mdr1 mRNA P-gp U251 U251/Dox t 135.78±13.09 210.32±7.85 8.46＊0.32±0.11 0.72±0.13 4.21＊

2.3 P-gp蛋白表達情況 U251細胞中P-gp弱陽性表達；U251/Dox細胞P-gp陽性表達，較U251細胞明顯增強，見表2。

3 討論

目前臨床對腦膠質(zhì)瘤的治療是以手術(shù)及術(shù)后的放、化療為主要手段。大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤對放療敏感性較低，化療是膠質(zhì)瘤術(shù)后的重要手段，但效果一直很不理想，除了存在血腦屏障影響之外，腫瘤細胞對化療藥物的耐受也是重要原因。MDR是腫瘤細胞對結(jié)構(gòu)各異、作用機制不相同的多種化療藥物交叉耐藥，是腫瘤細胞免受化療藥物攻擊最重要的細胞防御機制，同時也是臨床上造成化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)率增高的主要原因之一。

人腦膠質(zhì)瘤耐藥現(xiàn)象的發(fā)生與多種基因及其產(chǎn)物異常有關(guān)，包括MDR、MRP及肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-re?lated protein,LRP)等。人類基因中MDR含有2個基因mdr1和mdr2，其中mdr1基因與一些腫瘤耐藥有關(guān)[2]。P-gp為mdr1基因表達產(chǎn)物，是一種ATP依賴性轉(zhuǎn)運蛋白，分子質(zhì)量為170 ku，其與抗腫瘤藥物結(jié)合后通過ATP提供的能量，將藥物泵出細胞外，導致細胞內(nèi)藥物濃度下降，而產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象[3-5]。

本實驗以人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251在體外經(jīng)過Dox多次篩選傳代建立U251/Dox耐藥模型。Rh123是一種疏水性熒光染料，可被激發(fā)出紅色熒光，易于用流式細胞儀測定,同時其化學結(jié)構(gòu)與很多抗癌藥物相似，是特異性較強的P-糖蛋白的底物，可有效地被表達P-gp的細胞排出胞外，對細胞毒性低，Rh123常用于替代抗癌藥物測定藥物在胞內(nèi)的蓄積情況。從Rh123泵出試驗結(jié)果，可看出U251/Dox細胞泵出率明顯高于U251細胞。同時RT-PCR及免疫組化結(jié)果顯示，在U251/Dox細胞中mdr1 mRNA和P-gp蛋白表達均高于U251細胞。

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤細胞多藥耐藥產(chǎn)生與mdr1過度表達和影響P-gp功能使細胞內(nèi)藥物蓄積減少、泵出增加有關(guān)，與之前文獻報道的蒽環(huán)類抗生素、鉑類等抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性機制的研究結(jié)果一致[6]。

[1]劉福生，張慶林，趙麗，等.膠質(zhì)瘤多藥耐藥細胞系C6/adr的建立及其耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究[J].中華神經(jīng)外科雜志，2001，17(2)：109-112.

[2]于如同，陳沖，石瓊,等.MDR1 shRNA對人腦膠質(zhì)瘤干細胞多藥耐藥性實驗研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2008，7(6)：494-497.

[3]潘強，楊學軍.膠質(zhì)瘤化療藥物耐藥性分子機制的研究[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2010，15(2)：118-122.

[4]王翔，游潮.膠質(zhì)瘤化療耐藥機制研究進展[J].華西醫(yī)學，2008，23(6)：1495-1496.

[5]Decleves X,Fajac A,Lehmann-Che J,et al.Molecular and function?al MDR1-Pgp and MRPs expression in human glioblastoma multi?forme cell lines[J].Int J Cancer,2002,98(2):173-180.

[6]Triller N,Korosec P,Kern I,et al.Multidrug resistance in small cell lung cancer:expression of P-glycoprotein,multidrug resistance protein 1 and lung resistance protein in chemo-naive patients and in relapsed disease[J].Lung Cancer,2006,54(2):235-240.