吡啶丙烯酸衍生物的合成及放射增敏作用的研究*

李 寧 周曉靚 施培基 王 浩 王榮先

放療增敏劑是目前腫瘤治療研究領(lǐng)域較熱門的一類藥物，一些增敏效果較好的藥物如硝基咪唑類由于具有神經(jīng)毒性而限制了其臨床應(yīng)用[1]。煙酰胺是近年來研究較多的放射增敏劑，與Carbogen氣體（95%O2+5%CO2）合用增敏效果更好，且毒性低[2-4]。Qin等[5]以煙酰胺為母體化合物通過結(jié)構(gòu)改造，合成了比母體化合物增敏作用更好、毒性更低的一系列化合物。但由于煙酰胺吡啶環(huán)的空間位阻作用，使這類煙酰氨基酸衍生物的合成較困難并且收率較低。本研究通過結(jié)構(gòu)改造，在這類化合物基礎(chǔ)上利用電子等排原理設(shè)計合成出了新型吡啶丙烯酸衍生物，即N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸，并應(yīng)用噻唑藍(lán)比色法（MTT實(shí)驗(yàn)）及集落形成實(shí)驗(yàn)觀察該化合物對體外HeLa細(xì)胞的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 3-吡啶丙烯酸（sigma公司）；2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥物室合成）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、1-羥基苯并三唑（HOBt）購自上海共價化學(xué)科技有限公司；磁共振氫譜用Varian Mercury Vx-300磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)；熔點(diǎn)用BUCHI 535測定（熔點(diǎn)未校正）；HeLa細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 化合物制備 錐形瓶中依次加入447 mg（0.003 mol）3-吡啶丙烯酸，671 mg（0.004 mol）2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽，800 mg（0.004 mol）EDC·HCl，540 mg（0.004 mol）HOBt，30 mL二氯甲烷，稍微搖勻后加入干燥重蒸后的三乙胺1.2 mL，室溫電磁攪拌5 h后過濾，依次用蒸餾水（12 mL×1次）、碳酸氫鈉飽和溶液（12 mL×3次）、蒸餾水（12 mL×3次）洗滌二氯甲烷反應(yīng)液，再用無水硫酸鈉干燥過夜。蒸除二氯甲烷，得到黃白色粉末，用乙酸乙酯-環(huán)己烷重結(jié)晶。將所得固體與3 mL 2.5%氫氧化鈉水溶液完全反應(yīng)，用濃鹽酸調(diào)pH至4～5，析出白色沉淀，過濾干燥后即得產(chǎn)品。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 設(shè)有氧培養(yǎng)組和乏氧培養(yǎng)組。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，乏氧培養(yǎng)組于照射前30 min置于充有氮?dú)獾拿荛]容器中培養(yǎng)。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰酶消化計數(shù)將2×107/L細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL，貼壁培養(yǎng)12 h后，分別加1、2、4、8、16、32 mmol/L濃度的藥液，每種濃度設(shè)平行3孔，設(shè)不加藥的培養(yǎng)基（含血清）為空白對照。加藥培養(yǎng)12 h及24 h后每孔加入25 μL（5 g/L）MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。乏氧培養(yǎng)組在每個培養(yǎng)周期最后30 min置于氮?dú)庵信囵B(yǎng)。吸出培養(yǎng)液加入150 μL的DMSO，振搖5 min，用酶標(biāo)儀于492 nm波長測吸光度，計算細(xì)胞抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.2.4 集落形成實(shí)驗(yàn) 根據(jù)不同照射劑量接種不同細(xì)胞數(shù)于6孔板，每個劑量組分別設(shè)有氧單純照射組、有氧照射+給藥組、乏氧單純照射組及乏氧照射+給藥組，每種劑量設(shè)平行3孔。給藥組培養(yǎng)12 h后加入藥液，孵育24 h后（乏氧組于照射前在氮?dú)庵信囵B(yǎng)30 min）按不同劑量照射。照射采用137Cs（Gammacell 40，加拿大產(chǎn)）γ射線進(jìn)行照射，劑量率0.807 Gy/ min，設(shè)計照射劑量為0、1、2、3、4、6、8 Gy。照射后1 h更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6 d。吸出培養(yǎng)液，加甲醇固定3 min，0.1%結(jié)晶紫染色2 min，顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)（含有≥50個細(xì)胞的集落），取平行3孔的平均數(shù)計算集落形成率。利用軟件sigmaplot 10，采用多靶單擊模型S=1-(1-e-D/D0)N,在半對數(shù)坐標(biāo)上以照射劑量為橫坐標(biāo)，細(xì)胞生存分?jǐn)?shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，擬合細(xì)胞存活曲線，并根據(jù)Dq=D0/lnN計算該化合物的放射增敏參數(shù)，得出放射增敏比（SER）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化合物合成結(jié)果 N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸為白色粉末，總收率78%，純度99.2%，熔點(diǎn)為225℃～226℃（分解），結(jié)構(gòu)式見圖1。1H-NMR（DMSO）：δ=0.916（t,3H,-CH3）,1.743（m, 2H,-CH2-）,4.270（m,1H,-NH-）,6.852（d,1H,-HC=C（α）H-）,7.463（d,1H,-H（β）C=CH-）,7.967（d,1H,5-H pyr）,8.406（d,1H,4-H pyr）,8.540（s,1H,6-H pyr）, 8.744（s,1H,2-H pyr）,12.647（s,1H,-COOH）。MS： C12H14N2O3,M+=234.1(計算值為234.1)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 加藥培養(yǎng)12 h組的細(xì)胞抑制率無明顯規(guī)律，24 h組結(jié)果顯示N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸作用于HeLa細(xì)胞抑制率隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，相關(guān)數(shù)據(jù)見表1、2。各藥物濃度抑制率24 h組與12 h組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。根據(jù)24 h組結(jié)果得到該化合物有氧條件下對Hela細(xì)胞的50%細(xì)胞死亡所需藥物濃度（IC50）和20%細(xì)胞死亡所需藥物濃度（IC20）分別為12.30和1.66 mmol/L，乏氧條件下分別為8.37和1.32 mmol/L。采用化合物的IC20作為放射增敏實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。

表1 有氧條件下不同藥物濃度的細(xì)胞抑制率（n=3,%±s）

表1 有氧條件下不同藥物濃度的細(xì)胞抑制率（n=3,%±s）

＊＊P＜0.01

藥物濃度（mmol/L） 12 h 24 h t -33.949＊＊77.623＊＊44.837＊＊54.347＊＊24.174＊＊57.681＊＊012481 6 32 0.00 2.22±0.11 13.48±0.14 15.16±0.89 10.42±0.55 24.20±1.09 19.71±0.96 0.00 8.32±0.29 29.64±0.33 47.49±0.87 32.00±0.41 56.49±2.04 80.52±1.55

表2 乏氧條件下不同藥物濃度的細(xì)胞抑制率（n=3,%，±s）

表2 乏氧條件下不同藥物濃度的細(xì)胞抑制率（n=3,%，±s）

＊＊P＜0.01

藥物濃度（mmol/L） 12 h 24 h t -45.262＊＊37.985＊＊32.614＊＊36.161＊＊55.130＊＊50.833＊＊012481 6 32 0.00 1.03±0.24 3.17±0.09 12.53±0.41 20.70±0.86 28.19±1.03 23.03±1.09 0.00 11.32±0.31 37.50±1.56 49.61±1.93 52.61±1.27 67.17±0.66 83.25±1.74

2.3 HeLa細(xì)胞的放射增敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 照射后HeLa細(xì)胞集落形成能力隨照射劑量的增加而下降，且在同一照射劑量，照射+給藥組集落形成率明顯低于單純照射組，乏氧培養(yǎng)組集落形成率明顯低于相應(yīng)有氧培養(yǎng)組,見圖2。根據(jù)“多靶單擊模型”計算出N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸對HeLa細(xì)胞的有氧放射增敏比為1.44，乏氧放射增敏比為1.84。說明該化合物可增加HeLa細(xì)胞的放射敏感性，多靶單擊模型主要參數(shù)見表3。

圖2 照射存活曲線

表3 多靶單擊模型主要參數(shù)

3 討論

本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)測定N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸對HeLa細(xì)胞的毒性，文獻(xiàn)報道煙酰氨基酸衍生物IC50為10 mmol/L[5]，因此本實(shí)驗(yàn)以該濃度為依據(jù)設(shè)計不同濃度（1、2、4、8、16、32 mmol/L）進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中測定加藥培養(yǎng)12 h和24 h后細(xì)胞存活率，以測定藥物對HeLa細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示加藥孵育24 h后作用較明顯，故采用該時間為照射前細(xì)胞培養(yǎng)的最佳時間，N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸在體外實(shí)驗(yàn)中對HeLa細(xì)胞的毒性作用較小，有氧培養(yǎng)組和乏氧培養(yǎng)組IC50分別為12.30 mmol/L和8.37 mmol/L。為了降低藥物的細(xì)胞毒性對實(shí)驗(yàn)的影響，通常采用藥物的IC20作為給藥劑量進(jìn)行照射實(shí)驗(yàn),因此增敏實(shí)驗(yàn)采用藥物濃度為有氧組1.66 mmol/L，乏氧組1.32 mmol/L。

本研究顯示有氧培養(yǎng)和乏氧培養(yǎng)組中，照射+給藥組Dq、D0值均小于單純照射組，可知該化合物對有氧和乏氧的HeLa細(xì)胞均有增敏作用。照射增敏實(shí)驗(yàn)中，乏氧培養(yǎng)組所用藥物濃度小于有氧培養(yǎng)組，但其放射增敏比（1.84）明顯高于有氧培養(yǎng)組（1.44），表明其對乏氧細(xì)胞有較好的增敏作用。

煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，廣泛分布于體內(nèi)，導(dǎo)致煙酰胺作為放療增敏劑使用時腫瘤靶向性較差[6]。有研究表明煙酰胺側(cè)鏈引入氨基酸得到煙酰胺基酸衍生物可加強(qiáng)其放射增敏作用，可能的機(jī)制為藥物通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑到達(dá)腫瘤組織，增加了其腫瘤靶向性[7]，但此類化合物的合成過程中需利用疊氮法，毒性較大，合成方法復(fù)雜[5]。本實(shí)驗(yàn)合成的N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸是全新化合物，設(shè)計原理是在煙酰胺基酸衍生物基礎(chǔ)上引入一個雙鍵側(cè)鏈,增加了其側(cè)鏈長度，從而大大降低了引入氨基酸時吡啶環(huán)的空間位阻作用。與文獻(xiàn)報道的通過疊氮法合成煙酰胺基酸衍生物相比[5]，本實(shí)驗(yàn)未使用活潑試劑，僅在室溫下通過縮合反應(yīng)和水解反應(yīng)即可得到產(chǎn)物，反應(yīng)條件溫和，降低了合成難度，產(chǎn)率較高（78%），與文獻(xiàn)報道的生物結(jié)果相當(dāng)[5],且簡化了合成方法，有較好的應(yīng)用前景。

本研究合成了N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸，并初步評價了其細(xì)胞毒性及其放射增敏作用，證明該化合物對體外HeLa細(xì)胞有放射增敏作用，但其增敏機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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