不同原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的研究

沈晴昳

人牙髓細(xì)胞體外培養(yǎng)體是研究人牙髓細(xì)胞特性、牙髓組織活動(dòng)及牙髓修復(fù)機(jī)制的主要體外模型。但由于人牙髓組織量少，細(xì)胞活性低,原代培養(yǎng)成功率較低。因此，筆者通過(guò)優(yōu)化人牙髓細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法和條件，以期提高人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率，為進(jìn)一步研究人牙髓細(xì)胞的生物學(xué)特性提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2008年1月—3月于我院就診的患者28例，年齡12～20歲，平均14歲，因正畸減數(shù)或阻生需要拔除的健康、完整的雙尖牙共45顆，均經(jīng)患者本人及家屬知情同意。牙齒拔除后使用無(wú)菌高速渦輪機(jī)金剛砂車針沿牙骨質(zhì)-牙本質(zhì)界進(jìn)行環(huán)形切割，移至超凈臺(tái)內(nèi)，PBS液反復(fù)沖洗后劈開(kāi)冠根，輕柔取出牙髓組織，去除根尖孔端約2 mm部分，置D-Hanks液中備用。

1.2 主要儀器與試劑 CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus,德國(guó)），超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），倒置相差顯微鏡（Leica,德國(guó)）;Axioshop-Plus攝影顯微鏡（ZEISS,德國(guó)）,Z2型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Beckman Coulter,美國(guó)），培養(yǎng)瓶（25 cm2）、培養(yǎng)皿（直徑6 mm，21 cm2）、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Cornning,美國(guó)）、蓋玻片（海門(mén)昌隆儀器有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（Gibco，美國(guó)）、Ⅰ型膠原酶/Dispase（Sigma，美國(guó)）、即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德）。

1.3 方法

1.3.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng) 采用3種不同培養(yǎng)方法，每種各15例。（1）組織塊法：在超凈臺(tái)內(nèi)將人牙髓組織置于小平皿內(nèi)，在含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基浸潤(rùn)下充分剪碎，呈約0.5～1.0 mm3大小，用牙科探針將組織碎塊移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以0.5 cm間距均勻擺置。培養(yǎng)瓶中加入少量含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，瓶底向上，放入37℃、5%CO2的飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中，3.5 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)。（2）酶消化法：將人牙髓組織在完全培養(yǎng)液浸潤(rùn)下剪碎，呈約0.5～1.0 mm3大小，以3 g/L的I型膠原酶和4 g/L的dis?pase等量混合(體積比為1∶1)為消化液，用量為組織量的30～50倍，取約5 mL于37℃水浴搖床溫和振蕩，消化1 h，終止消化后1 200 r/min離心10 min，收集細(xì)胞并用培養(yǎng)液清洗2次，加入含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)置塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)37℃恒溫培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。（3）改良組織塊法：在完全培養(yǎng)液充分浸潤(rùn)條件下用眼科剪將牙髓組織剪成約0.5～1.0 mm3大小的組織塊。在直徑6 mm的培養(yǎng)皿的底壁滴加1滴含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，用牙科探針將組織碎塊移入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液滴中，使每滴培養(yǎng)液內(nèi)約含8～10小塊組織。用少量無(wú)菌凡士林涂抹于消毒后的蓋玻片邊緣后，將蓋玻片緩慢覆蓋于組織塊上，輕輕加壓，通過(guò)凡士林將蓋玻片黏附在培養(yǎng)皿底壁，以固定組織塊。覆蓋時(shí)應(yīng)注意使培養(yǎng)液完全充盈于蓋玻片與組織塊之間，切勿產(chǎn)生氣泡，加入含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液放入培養(yǎng)箱中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.2 傳代方法 在倒置顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)方法的組織塊貼壁和細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。組織塊法和改良組織塊法培養(yǎng)時(shí)，在組織塊內(nèi)未游出細(xì)胞前每7 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞游出后則3 d換液1次。待細(xì)胞單層生長(zhǎng)到覆蓋瓶底的50%～60%以上時(shí)進(jìn)行首次傳代，傳代比例為1∶1，以后傳代時(shí)機(jī)為細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底80%～90%，傳代比例為1∶2。酶消化法3 d換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合態(tài)時(shí)，按1∶2消化傳代。

1.3.3 細(xì)胞來(lái)源鑒定及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 分別取3種不同培養(yǎng)方法獲得的第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人牙髓細(xì)胞細(xì)胞爬片，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白免疫組化染色，光鏡下觀察。取3種不同培養(yǎng)方法獲得的第3代人牙髓細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，每3 d換液1次，接種后每天消化5孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)9 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 組織塊法原代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和形態(tài)學(xué)觀察 各例培養(yǎng)瓶中牙髓組織塊約1/3能緊密貼附于培養(yǎng)瓶壁。傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞4例成功，成功率26.7%。成功的4例于8～15 d時(shí)細(xì)胞從組織塊邊緣游出，呈草叢狀生長(zhǎng)，隨生長(zhǎng)密度逐漸增加，細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀排列，見(jiàn)圖1。細(xì)胞游出3～4周后覆蓋瓶底達(dá)60%～70%順利首次傳代，但細(xì)胞生長(zhǎng)增殖較緩慢。傳代3～4次后生長(zhǎng)周期趨于穩(wěn)定，平均每7 d傳代一次。獲得的牙髓細(xì)胞主要是成纖維樣細(xì)胞，形態(tài)多為長(zhǎng)梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，核圓，核仁清晰，個(gè)別培養(yǎng)瓶中可見(jiàn)少量?jī)?nèi)皮樣細(xì)胞。有8例雖有個(gè)別組織塊邊緣有細(xì)胞游出，但因生長(zhǎng)緩慢而無(wú)法成功傳代。其余3例，直至第28天仍未見(jiàn)組織塊內(nèi)游出細(xì)胞。

2.2 酶消化法原代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和形態(tài)學(xué)觀察 酶消化牙髓組織后能獲得大量細(xì)胞，主要是成纖維樣細(xì)胞，偶見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)的梭形細(xì)胞和少量多角形內(nèi)皮樣細(xì)胞團(tuán)塊，能存活、貼壁的細(xì)胞只占少數(shù)，且細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，見(jiàn)圖2。15例中僅有2例分別于12 d和14 d首次傳代，2例分別于第3天、第5天出現(xiàn)污染，其余11例細(xì)胞均達(dá)不到傳代要求，成功率13.3%。

2.3 改良組織塊法原代細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)學(xué)觀察 12例培養(yǎng)成功。培養(yǎng)皿中所有組織塊均被固定在底壁，未見(jiàn)懸浮的組織塊。15例牙髓組織中，有12例在3～10 d內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞游出，其余3例在28 d內(nèi)未見(jiàn)細(xì)胞游出，視為培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)成功率80.0%。倒置相差顯微鏡下,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),幾乎所有的組織塊周圍都有細(xì)胞游出，且細(xì)胞密度明顯增加，肉眼觀察組織塊周邊可見(jiàn)明顯的生長(zhǎng)暈，見(jiàn)圖3。細(xì)胞從組織塊中游出2～3周后，12例牙髓原代細(xì)胞均能成功傳代，傳代后第2天，懸浮的細(xì)胞又貼壁生長(zhǎng)，呈條梭形，均勻地分布于整個(gè)培養(yǎng)皿底壁，牙髓細(xì)胞增殖活躍，見(jiàn)圖4。

2.4 細(xì)胞來(lái)源鑒定 3種不同方法獲得的細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色均顯示波形絲蛋白呈陽(yáng)性，陽(yáng)性顆粒在胞漿內(nèi)分布均勻，角蛋白呈陰性，見(jiàn)圖5。

2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 3種不同培養(yǎng)方法獲得的人牙髓細(xì)胞均在接種后的第1天細(xì)胞數(shù)量有所下降，第2、3天細(xì)胞開(kāi)始增殖，速度較緩慢，從第4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，直至第8天進(jìn)入平臺(tái)期，第9天細(xì)胞數(shù)量略有減少，生長(zhǎng)曲線均呈“S”形，其中酶消化法較其他2種方法所得牙髓細(xì)胞的生長(zhǎng)情況略差，見(jiàn)圖6。

圖6 不同原代培養(yǎng)方法所獲第3代人牙髓細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

3 討論

牙髓組織是一種胚胎性、嬌嫩的疏松結(jié)締組織，含有成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、組織細(xì)胞和未分化間充質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞成分。在一定程度范圍內(nèi)遭受損傷、感染等不良刺激后，牙髓組織具有再生修復(fù)潛能。牙髓細(xì)胞培養(yǎng)是研究牙髓生物特性的主要模型和重要手段。但由于人牙髓組織量少，細(xì)胞活性低，且隨著年齡增長(zhǎng)易發(fā)生退行性病變，所以牙髓組織比其他組織更難于進(jìn)行原代培養(yǎng)［1-2］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種不同方法所獲取的細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色均顯示波形絲蛋白陽(yáng)性、角蛋白陰性，提示細(xì)胞來(lái)源于外胚間葉組織，非上皮來(lái)源，符合牙髓組織學(xué)特征。

酶消化法是體外獲取細(xì)胞的常用方法之一。但有研究認(rèn)為，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間或者高濃度酶消化作用后大量細(xì)胞被滅活，甚至可破壞細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞表面通透性升高，活力下降，生長(zhǎng)緩慢，難以成功傳代[3]。Gronthos等[4]首次將中性蛋白酶dispase與Ⅰ型膠原酶聯(lián)合應(yīng)用消化人牙髓組織，獲得增殖力強(qiáng)、克隆形成率高并有分化潛能的具備干細(xì)胞特性的細(xì)胞群。但劉俊等[5]研究表明相對(duì)于其他組織而言，牙髓組織量太小，總體細(xì)胞量過(guò)少，Ⅰ型膠原酶在消化酶解人牙髓組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅰ型膠原的同時(shí)，對(duì)牙髓細(xì)胞也有毒性作用；中性蛋白酶dispase性質(zhì)柔和，不會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損害，與Ⅰ型膠原酶聯(lián)合應(yīng)用后雖可減輕對(duì)細(xì)胞的毒性作用，但是必須保證足夠的消化時(shí)間才能使牙髓組織完全解離，而人牙髓組織代謝需求高，酶消化處理使其脫離營(yíng)養(yǎng)環(huán)境過(guò)久同樣會(huì)造成大量細(xì)胞死亡。與組織塊法比較，單純酶消化法雖可獲得大量細(xì)胞，但由于酶對(duì)細(xì)胞的毒性作用，能存活壁的細(xì)胞數(shù)量卻極少，同時(shí)由于其操作繁瑣、易污染而較少采用,本研究中此法僅2例培養(yǎng)成功。

組織塊法操作簡(jiǎn)單易行，已被廣泛應(yīng)用于頜下腺[6]、嗅上皮[7]、主動(dòng)脈平滑肌[8]等各種組織的原代培養(yǎng)中。影響組織塊貼壁的因素很多，包括組織塊本身的性狀、大小和干燥程度[9]。有報(bào)道組織塊法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的成功率在10%左右，且失敗的主要原因是組織塊貼壁率較低[10]。在本研究中，筆者亦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)的時(shí)間很難掌握，過(guò)早翻轉(zhuǎn)，組織塊則因尚未牢固貼壁而易漂浮，如若翻轉(zhuǎn)過(guò)晚，組織塊因脫離營(yíng)養(yǎng)環(huán)境過(guò)久，細(xì)胞不能游出，這些都可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。

綜上，本研究對(duì)常規(guī)組織塊法進(jìn)行的改良，使用蓋玻片覆蓋并固定牙髓組織塊，簡(jiǎn)化了操作步驟，增加了組織塊與培養(yǎng)皿的接觸面積，更減少了翻轉(zhuǎn)加液及搬運(yùn)過(guò)程中外力對(duì)貼壁組織塊的沖擊作用，解決了組織塊的貼壁難的問(wèn)題，提高了培養(yǎng)的成功率。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)受到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院的張秀麗老師、朱亞琴老師和江龍醫(yī)師的大力幫助，在此致以衷心的感謝）

[1]Coppe C,Zhang Y,Den Besten PK.Characterization of primary den?tal pulp cells in vitro[J].Pediatr Dent,2009,31(7):467-471.

[2]姜新朋,張穎麗,黃洋,等.組織塊法培養(yǎng)成體人牙髓細(xì)胞的增殖及分化狀態(tài)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(28): 5416-5420.

[3]蔣俊強(qiáng),王忠朝,黎春暉,等.三種方法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(23):4290-4294.

[4]Gronthos S,Mankani M,Branhim J,et al.Postnatal human dental stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(25):13625-13630.

[5]劉俊,李玉晶.應(yīng)用不同方法進(jìn)行人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)的比較研究[J].北京口腔醫(yī)學(xué),2005,13(3):148-152.

[6]黃巍巍,譚學(xué)新,李波,等.組織塊法培養(yǎng)大鼠頜下腺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,39(3):194-196.

[7]羨慕,張羅,王鴻,等.嗅上皮的組織塊培養(yǎng)法[J].中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科,2010,17(4):171-174.

[8]許歡,陳鑫,邱志兵,等.組織貼塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及鑒定[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2009,38(11):64-66.

[9]劉少華,魏奉才,孫善珍,等.牙髓細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法探討：冠部和根部牙髓的比較[J].上海口腔醫(yī)學(xué),2004,13(2):103-105.

[10]盧婧,唐榮銀,李彥.人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的比較研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2006,16(6):311-313.