特異性免疫玻片法在外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)中的應(yīng)用

呂衛(wèi)東 張平安

特異性免疫玻片法在外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)中的應(yīng)用

呂衛(wèi)東1張平安2

本文2010-07-06收到,2010-10-25接受

目前,T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+和CD 8+)的檢測(cè)是觀察機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)[1]。流式細(xì)胞術(shù)作為 CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法,由于儀器及配套檢測(cè)試劑費(fèi)用昂貴,難以在基層醫(yī)院推廣和應(yīng)用。因此需要一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、價(jià)廉的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞檢測(cè)方法。本研究應(yīng)用免疫玻片法檢測(cè)全血CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞,并與經(jīng)典的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行比較,考察了兩種方法的相關(guān)性,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

120份全血標(biāo)本來自本院住院患者和體檢人群,其中住院患者100例,涉及的疾病有腫瘤、病毒性感染、自身免疫病、創(chuàng)傷、心血管疾病和糖尿病等。體檢人群20例,為體檢中各指標(biāo)均正常的健康者。

1.2 儀器和試劑

Epics XL流式細(xì)胞儀及CD3+/CD4+/CD8+檢測(cè)試劑均由美國(guó)Beckman-Coulter公司提供。CD3+、CD4+和CD 8+T細(xì)胞檢測(cè)玻片及配套試劑均由上海匯中細(xì)胞生物科技有限公司提供。Sysmex SF3000型細(xì)胞分析儀及試劑,均由日本Sysmex公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集:采集靜脈血2m l,EDTA抗凝后,2～8℃保存,分別用流式細(xì)胞術(shù)和玻片法檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù),同時(shí)進(jìn)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群:取CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三色標(biāo)記的單克隆抗體20μl加入Tru COUNT試管管底,然后加入抗凝新鮮全血 100μl,充分混勻,室溫避光孵育30～60min,再分別加入溶血?jiǎng)?、緩沖液和固定液,其間振蕩混勻,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。檢測(cè)前用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球通過FACS Comp軟件自動(dòng)校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀,再上樣進(jìn)行 CD3+/CD4+/CD8+檢測(cè),得到全血中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù),結(jié)合全血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果,換算得到CD 3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的絕對(duì)值(個(gè)/μl)。

1.3.3 免疫玻片法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群:將20μl全血加入到 380μl磷酸鹽緩沖液中混勻,分別取5μl稀釋后全血加入到CD3、CD4和CD8抗體包被區(qū),室溫孵育40min,用磷酸鹽緩沖液對(duì)玻片進(jìn)行清洗,再用過氧化酶染色液通過細(xì)胞染色去除單核細(xì)胞等非特異性細(xì)胞,然后再用復(fù)染液對(duì)CD細(xì)胞進(jìn)行染色。即可采用普通光學(xué)顯微鏡或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù),所得計(jì)數(shù)結(jié)果乘以4,即為每μl外周血中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)值。為保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,檢測(cè)前用標(biāo)準(zhǔn)片上機(jī)進(jìn)行測(cè)試;檢測(cè)完成后,再用標(biāo)準(zhǔn)片驗(yàn)證一次,要求兩次結(jié)果均在控制范圍內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料均輸入計(jì)算機(jī),應(yīng)用描述性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)和t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,并使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩種方法所測(cè)得的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析和Bland-A ltman散點(diǎn)圖分析。以相關(guān)系數(shù)(r)大于0.8表示兩方法之間具有顯著相關(guān)性,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 特異性免疫玻片法和流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)比較

兩種方法檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及中位數(shù)等的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。經(jīng)t檢驗(yàn),免疫玻片法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 兩種檢測(cè)方法的結(jié)果比較

2.2 兩種方法的相關(guān)性分析

免疫玻片法與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+T細(xì)胞的r為0.96,平均絕對(duì)誤差為-21個(gè)細(xì)胞/μl;CD4+T細(xì)胞的 r為0.98,平均絕對(duì)誤差為3個(gè)細(xì)胞/μl;CD 8+T細(xì)胞的r為0.94,平均絕對(duì)誤差為26個(gè)細(xì)胞/μl,見圖1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,兩種方法檢測(cè)的CD 3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)具有顯著相關(guān)性。

圖1 兩種方法計(jì)數(shù)CD3+、CD 4+和CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

從120份全血標(biāo)本中隨機(jī)抽取20份,應(yīng)用免疫玻片法分別檢測(cè)兩次CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD3+、CD4+和CD 8+T細(xì)胞的變異系數(shù)(CV)分別＜7%、7%和12%。

3 討 論

T淋巴細(xì)胞亞群是調(diào)控細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞,大量研究表明,其絕對(duì)數(shù)和比值是衡量個(gè)體免疫狀態(tài)及功能的重要指標(biāo)[2]。流式細(xì)胞術(shù)是目前細(xì)胞CD分化抗原檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法,但由于儀器及檢測(cè)試劑昂貴、檢測(cè)人員需經(jīng)特殊專業(yè)培訓(xùn)、儀器維護(hù)復(fù)雜等原因,很難在基層醫(yī)院普遍推廣應(yīng)用。同時(shí),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的是CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比,只能顯示T淋巴細(xì)胞亞群的構(gòu)成比例,無法直接反映各亞群細(xì)胞的絕對(duì)水平[3],若要獲得各亞群細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量,需進(jìn)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)后再換算,操作較復(fù)雜。

本研究所用的免疫玻片法突破傳統(tǒng)的特異性細(xì)胞檢測(cè)思路,采用逆向思維,即不用抗體來標(biāo)記細(xì)胞,而是用事先包被有特異性抗體的玻片來捕捉游離的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞,通過洗滌除去非特異CD抗原表達(dá)細(xì)胞,再用細(xì)胞化學(xué)染色法區(qū)分T淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞,然后利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)控制普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行 T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)。本文對(duì)120例不同人群全血CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明,免疫玻片法與流式細(xì)胞術(shù)具有顯著相關(guān)性和較小的檢測(cè)差異,而且重復(fù)性好。因此,免疫玻片法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群,具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)適用等特點(diǎn),可較好滿足健康體檢人群及貧困邊遠(yuǎn)和衛(wèi)生資源缺乏地區(qū)對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的需要,同時(shí)可為病人減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),使其更廣泛的應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的輔助診斷、病程監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估。

本文第一作者簡(jiǎn)介:

呂衛(wèi)東(1967～),男,漢族,主管技師

1 陳偉烈,袁小平,唐小珍,等.登革熱病毒感染者外周血 T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的變化及其臨床意義.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(11):1 042～1 044.

2 楊 波,祁巖超,盧敏瑩,等.流式細(xì)胞術(shù)分析六類腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的變化.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2006,20(2):81～83.

3 Bisset LR,Lung TL,Kaelin M,et al.Reference values fo r peripheral blood lymphocy te phenol-types applicab le to the healthy adult population in Sw itzerland.Eur J Haem atol,2004,72(3):203～212.

特異性免疫玻片法在外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)中的應(yīng)用

呂衛(wèi)東,張平安/湖北省蘄春縣第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,蘄春435300

目的:探討一種非流式T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的新方法。方法:采用特異性免疫玻片法對(duì)120份全血CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),并與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:兩種方法檢測(cè) CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.96、0.98和0.94,平均絕對(duì)誤差分別為-21個(gè)細(xì)胞/μl、3個(gè)細(xì)胞/μl和26個(gè)細(xì)胞/μl。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論:免疫玻片法可準(zhǔn)確進(jìn)行全血T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù),并具有試劑價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn),適用于基層和衛(wèi)生資源缺乏地區(qū)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。

R331.3+5

A

1005-1740(2011)01-0051-03

1湖北省蘄春縣第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,郵政編碼 蘄春435300;2武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科; 通訊作者:張平安,E-mail:zhangpingan@yahoo.com.cn

免疫玻片法 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析 T淋巴細(xì)胞亞群