脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)用于血管再生性治療的研究進(jìn)展

周佳雁綜述 馬向華審校

脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)用于血管再生性治療的研究進(jìn)展

周佳雁綜述 馬向華審校

當(dāng)組織發(fā)生缺血性病變時(shí),機(jī)體會(huì)以自發(fā)生成新血管方式緩解缺血缺氧、延緩疾病進(jìn)展。但是,在一些存在動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素及其他全身性疾病的患者,機(jī)體的這種自發(fā)血管生成機(jī)制受到限制。因而需研究針對(duì)這種缺血性疾病的新治療方法——“血管再生性治療”,而在大部分實(shí)驗(yàn)和臨床前研究中主要采用干細(xì)胞移植。本文就脂肪源性干細(xì)胞(Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)用于血管再生治療的研究進(jìn)展作一綜述。

1 ADSCs的特點(diǎn)及其促血管生成研究

1.1 干細(xì)胞的選擇及ADSCs的特點(diǎn)

成人的血管再生可以動(dòng)員骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone M arrow-derived M esenchymal Stem Cells,BM-MSCs)來(lái)完成,通過(guò)骨髓動(dòng)員的EPCs進(jìn)入外周循環(huán)中,最后至遠(yuǎn)端器官而發(fā)揮促血管再生作用。研究表明EPCs能對(duì)內(nèi)皮損傷產(chǎn)生應(yīng)答作用[1];移植培養(yǎng)的EPCs參與新生血管形成及損傷的動(dòng)脈血管壁再內(nèi)皮化也獲得成功。但因EPCs的培養(yǎng)很困難,自我更新能力較差等缺陷[2],使其在臨床研究中受到限制。BM-MSCs是目前關(guān)注較多的干細(xì)胞,且動(dòng)物模型及臨床應(yīng)用均證實(shí)通過(guò)移植BM-MSCs至缺血骨骼肌可成功促使血管形成[3]。但自體移植BM-MSCs治療缺血性疾病存在很多限制因素,如操作方法的侵襲性太大,促使血管形成的機(jī)制目前尚不成熟,臨床試驗(yàn)顯示這種方法對(duì)治療周圍血管閉塞性疾病晚期患者效果較差[4]。因此,近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始尋求新的干細(xì)胞。

國(guó)外研究資料[5]顯示,脂肪組織中含有大量能夠貼壁培養(yǎng)、快速增殖、具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞ADSCs,且來(lái)源廣泛、便利,對(duì)供者的損傷也小,即使是很少量的人皮下脂肪組織,都可以分離出這種細(xì)胞,并且可以培養(yǎng)擴(kuò)增[6]。有報(bào)道稱,從2006年起,美國(guó)每年經(jīng)脂肪抽吸術(shù)獲得且沒(méi)有妥善利用的皮下脂肪組織超過(guò)3L[7],而經(jīng)過(guò)提純可獲得的ADSCs約為400 000個(gè)細(xì)胞/m l[8]。因此,自體皮下脂肪是很好的干細(xì)胞來(lái)源。Peroni等[9]發(fā)現(xiàn)60種同時(shí)參與人ADSCs及人BM-MSCs基因組的基因,都能影響組織生長(zhǎng)、修復(fù)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài);也有研究發(fā)現(xiàn)[10～13]ADSCs與 BMMSCs相似,亦可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞等。因此,很多關(guān)于ADSCs促血管再生治療缺血性疾病的研究正逐漸開(kāi)展。

1.2 ADSCs促血管再生的研究現(xiàn)狀

國(guó)內(nèi)外大量研究顯示ADSCs可以促血管形成,從而成功治療缺血性疾病。M adonna等[14]在體外將鼠ADSCs分別接種于甲基纖維素培養(yǎng)基Methocu lt M 3534及基質(zhì)膠(Matrigel)上,培養(yǎng)過(guò)程中均出現(xiàn)接種的ADSCs形成分支管狀的結(jié)構(gòu)網(wǎng)。Kang等[15]認(rèn)為ADSCs可有效促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促新生血管形成。M iranville等[16]將ADSCs肌肉注射至小鼠缺血下肢,移植后局部血流量明顯改善,且局部毛細(xì)血管密度顯著增加。Kondo等[17]在下肢缺血的小鼠模型中以肌肉注射磷酸鹽緩沖溶液為對(duì)照,分別肌肉注射ADSCs及成熟脂肪細(xì)胞(M As),結(jié)果顯示移植ADSCs組血流灌注得到更好的改善。但有趣的是,相對(duì)于注射磷酸緩沖溶液組,肌注M As組促血管生成的能力更差。研究其原因可能呈 MA s分泌的一些細(xì)胞因子,包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)等,在MAs促血管形成中起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[18]。Hong等[19]報(bào)道的早期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,ADSCs通過(guò)促血管形成、改善局部血供,可緩解很多缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展,包括急性心肌梗死、周圍血管性疾病、骨及軟組織損傷、Crohn's瘺管、皮膚損傷。

2 ADSCs促血管再生的機(jī)制

關(guān)于ADSCs治療缺血性疾病的機(jī)制,目前尚存爭(zhēng)議。

2.1 ADSCs分化為內(nèi)皮系細(xì)胞促血管形成

以往研究均顯示,移植的ADSCs是在體內(nèi)分化為內(nèi)皮系細(xì)胞,如EPCs或成熟內(nèi)皮細(xì)胞(ECs),從而成功治療缺血性疾病。如Fischer等[20]將 ADSCs置于含 50μg/m l牛下丘腦提取物ECDS(一種內(nèi)皮細(xì)胞生成添加劑)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中,并予以適當(dāng)?shù)募羟辛?發(fā)現(xiàn)ADSCs可以分化為內(nèi)皮系細(xì)胞;Brzoska等[21]在ADSCs培養(yǎng)過(guò)程中加入全反式維甲酸二甲基亞砜,亦得到內(nèi)皮系細(xì)胞;國(guó)內(nèi)很多學(xué)者[22,23]使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(b-FGF)在體外誘導(dǎo)ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化也均已獲得成功。

但是近年來(lái)國(guó)外一些研究指出,脂肪組織中存在另一種間充質(zhì)細(xì)胞,即血管間充質(zhì)細(xì)胞(SVF),其包含了多能間充質(zhì)干細(xì)胞/祖細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、周細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞),從而可以分化為不同的細(xì)胞系,因此,即使ADSCs在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)成功分化為內(nèi)皮細(xì)胞,仍不能排除SVF在其中的干擾作用。Traktuev等[18]研究發(fā)現(xiàn)使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基 EGM-2不能將人ADSCs分化為ECs。M urohara[24]為模型動(dòng)物移植綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的ADSCs,發(fā)現(xiàn)移植的ADSCs不能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物。因此,目前關(guān)于ADSCs是否能向內(nèi)皮系細(xì)胞分化,尚存爭(zhēng)議。

2.2 ADSCs通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子促血管形成

近年來(lái)很多研究顯示ADSCs可分泌促血管生長(zhǎng)因子,如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Grow th Factor,HGF)、基質(zhì)衍生因 子-1(Stromal-Cell Derived Factor-1,SDF-1)、VEGF[24～26]等。Rehman等[27]研究發(fā)現(xiàn)每 106個(gè) ADSCs可分泌1 203±254 pg VEGF,若將 ADSCs置于缺氧環(huán)境中,ADSCs分泌VEGF水平可增加5倍左右,移植處內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)顯著增殖(P＜0.001),且凋亡明顯減少(P＜0.05)。有研究顯示,VEGF-A介導(dǎo)的促血管生成作用呈部分依賴SDF-1及其趨化因子受體 4(CXCR4)途徑的激活[28,29]。

2.2.1 HGF:最初認(rèn)為HGF是特異作用于肝細(xì)胞的細(xì)胞因子,近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示HGF具有促有絲分裂、促血管形成、抗凋亡等多種作用,可作用于多種不同的細(xì)胞[30-31]。以往有報(bào)道稱,在外周缺血模型中應(yīng)用ADSCs加速再灌注或進(jìn)行組織補(bǔ)救時(shí),ADSC可分泌生理水平的HGF。Zhu等[32]發(fā)現(xiàn),移植后的 ADSCs分泌的 HGF在血管形成過(guò)程中起到重要促進(jìn)作用,經(jīng)HGF基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后ADSCs的促血管形成、改善血供的能力顯著增加。Cai等[33]報(bào)道,敲除HGF基因后ADSCs促外周缺血組織再灌注能力下降,由此引起局部微血管密度下降?？梢?jiàn)ADSCs分泌的HGF對(duì)ADSCs的功能有很重要的影響。

2.2.2 SDF-1:SDF-1是一種趨化因子,最初從BM-MSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中分離。Tang等[34]證實(shí)SDF-1可增強(qiáng)干細(xì)胞在缺血疾病中的療效。Kondo等[17]在下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭幸约∪庾⑸淞姿猁}緩沖溶液為對(duì)照,移植ADSCs,發(fā)現(xiàn)經(jīng)ADSCs治療后小鼠體內(nèi)SDF-1 mRNA及其相關(guān)蛋白水平顯著升高,且缺血下肢的血流灌注得到明顯改善;但隨后予以SDF-1單克隆抗體干預(yù)后,ADSCs的療效顯著下降。

SDF-1的主要受體為CXCR4,后者大量表達(dá)于骨髓細(xì)胞,這就使得SDF-1有廣泛的效應(yīng)細(xì)胞。Heissig等[35]研究發(fā)現(xiàn)SDF-1可動(dòng)員CXCR4+的骨髓細(xì)胞,其中包括造血干細(xì)胞(HSCs)和EPCs。Kondo等[17]在下肢缺血的小鼠模型中移植ADSCs后,發(fā)現(xiàn)骨髓 EPCs含量明顯增加,由此認(rèn)為SDF-1可動(dòng)員EPCs。

目前研究顯示,與血管形成相關(guān)的受體主要為VEGF受體(VEGFR)、CXCR4+、酪氨酸蛋白激酶生長(zhǎng)因子受體(c-Kit),在分別經(jīng)其配體 VEGF-A、SDF-1、K it配體(KitL)激活后可發(fā)揮促血管生成作用。但有研究稱VEGF-A[29,34]與c-Kit促血管形成作用呈部分SDF-1-CXCR4+途徑激活依賴性。

SDF-1由ADSCs釋放后進(jìn)入外周血,通過(guò)復(fù)雜的胞吞[36]作用,從外周血中轉(zhuǎn)運(yùn)至骨髓腔內(nèi),進(jìn)而激活基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9),促使可溶性kit配體(sKitL)釋放。隨后,sKitL介導(dǎo)更多的SDF-1釋放,從而增強(qiáng)對(duì)CXCR4+及C-K it++細(xì)胞的動(dòng)員作用,使其進(jìn)入外周血[35]。另外,一氧化氮(NO)途徑亦可擴(kuò)大SDF-1作用。SDF-1可促使內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO,使MMP-9水平上調(diào)。A icher等[37]在敲除一氧化氮合成酶(NOS)的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)其MMP-9的激活、sK itL的釋放及促血管生成細(xì)胞均受損,由此可見(jiàn)NO在SDF-1介導(dǎo)的骨髓細(xì)胞動(dòng)員中起到十分重要的作用。

2.2.3 骨髓衍生循環(huán)細(xì)胞(RBCCs):ADSCs旁分泌SDF-1使得局部 SDF-1含量增多,從而使 VEGF表達(dá)上調(diào),而VEGF亦可反作用增加 SDF-1及 CXCR4的表達(dá)[38]。VEGF-SDF-1促血管生成作用的主要步驟包括動(dòng)員、轉(zhuǎn)移、募集至局部缺血部位、粘附、侵襲、捕獲及滯留 RBCCs。在這一過(guò)程中,VEGF及SDF-1起著核心作用。局部表達(dá)的VEGF可捕獲 RBCCs,刺激血管原位ECs增殖。SDF-1可增強(qiáng)VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮型NOS(eNOS)合成的相關(guān)通路,同時(shí)亦可募集CXCR+RBCCs。更重要的是,SDF-1可滯留募集的細(xì)胞,將這些細(xì)胞準(zhǔn)確定位在新生血管周圍組織,從而進(jìn)一步放大其促血管形成作用。募集并定位于缺血部位的RBCCs通過(guò)分泌血管生成因子[39],促使血管壁內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),改善局部血流灌注。

3 ADSCs在血管再生性治療中的問(wèn)題

雖然在體外培養(yǎng)及動(dòng)物模型中均已證實(shí)ADSCs移植后可促使血管形成、改善局部血流灌注,治療缺血性疾病。但是目前關(guān)于ADSCs臨床應(yīng)用前的研究仍存在很多尚待解決的問(wèn)題。

3.1 ADSCs的移植數(shù)量

在BM-M SCs促血管再生的動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn),注射過(guò)多的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致一些負(fù)作用,因此有必要研究注射移植ADSCs的最有效劑量。

3.2 ADSCs的分離方法

近年來(lái)報(bào)道的分離方法是將ADSCs予以膠原酶消化,隨后使用特定的裝備進(jìn)行機(jī)械離心分離。這種方法在整形外科手術(shù)中的脂肪組織再生中被證明是十分有效的[40,41],且不需要細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)及不需要建立細(xì)胞加工中心。如果兩種類型的ADSCs,即新分離的ADSCs和培養(yǎng)后的ADSCs在促血管分化能力上具有相似的能力,則有必要選擇使用一種機(jī)械裝備來(lái)進(jìn)行血管形成性治療。3.3 缺血性疾病移植ADSCs的療效評(píng)估

ADSCs的數(shù)量及功能與患者存在的并發(fā)癥及動(dòng)脈粥樣硬化等危險(xiǎn)因素相關(guān),例如在2型糖尿病[42]中SDF-1的分泌水平降低;存在多種危險(xiǎn)因素包括糖尿病、高血壓、高齡、吸煙等的患者,其體內(nèi)的祖細(xì)胞數(shù)量和功能降低。這些病癥通常存在于周圍動(dòng)脈閉塞性疾病及血管閉塞性脈管炎(Buerger's疾病)患者。但現(xiàn)在尚未明確ADSCs的數(shù)量及功能是否一定會(huì)受這些危險(xiǎn)因素的影響。因此,在使用促血管形成的治療學(xué)方法前,應(yīng)該對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行評(píng)估。

4 小結(jié)與展望

ADSCs來(lái)源廣泛、取材方便,且體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)可通過(guò)促血管形成、改善局部血供,緩解很多缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展,因此受到越來(lái)越多的研究者關(guān)注,成為可替代BM-MSCs的新的干細(xì)胞治療手段。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)ADSCs可分泌大量促血管生成的細(xì)胞因子,但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。雖然目前在ADSCs臨床應(yīng)用中還有許多尚待解決的實(shí)際問(wèn)題,但隨著研究的進(jìn)一步深入,相信在未來(lái),ADSCs可為缺血性疾病的治療帶來(lái)新的希望。

本文第一作者簡(jiǎn)介:

周佳雁(1985～),女,漢族,碩士研究生

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1005-1740(2011)01-0066-04

江蘇省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,郵政編碼 南京 210029本文2010-09-14收到,2010-11-26修回,2010-11-30接受