牛布魯氏菌病陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制

李翠，關(guān)孚時(shí)，戴志紅，蔣卉，溫芳，陸連壽，王在時(shí)

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081

牛布魯氏菌病陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制

李翠，關(guān)孚時(shí)，戴志紅，蔣卉，溫芳，陸連壽，王在時(shí)

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081

為制備標(biāo)定凝集試驗(yàn)用的牛布魯氏菌病陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品，采集 4份田間自然感染牛布魯氏菌病的陽性血清作為候選物，經(jīng)過篩選后，選擇了3#血清用于標(biāo)準(zhǔn)品制備。對該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了物理性狀、無菌檢驗(yàn)、真空度測定、剩余水分檢驗(yàn)、均勻性檢測和穩(wěn)定性試驗(yàn)，檢測結(jié)果均符合要求。以國際標(biāo)準(zhǔn)品為參比，測定了該標(biāo)準(zhǔn)品的RBT、SAT和CFT效價(jià)，結(jié)果分別為1∶160“+”、1∶2 400“++”、1∶800“++”，與協(xié)作標(biāo)定結(jié)果完全一致。該標(biāo)準(zhǔn)品以國際標(biāo)準(zhǔn)品溯源的國際單位含量為4 000 IU/mL。

牛布魯氏菌病，陽性血清，國家標(biāo)準(zhǔn)品，效價(jià)測定，均勻性，穩(wěn)定性

目前，血清學(xué)檢查是牛布魯氏菌病診斷的常用方法[3-6]，為了促進(jìn)其診斷試驗(yàn)的國際一體化和抗原標(biāo)準(zhǔn)化，世界衛(wèi)生組織 (World health organization，WHO) 生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會于 1952年建立了第一批牛布魯氏菌病陽性血清國際標(biāo)準(zhǔn)品[7](可從OIE的布魯氏菌參考實(shí)驗(yàn)室即英國衛(wèi)橋 Veterinary Laboratories Agency，VLA獲得)，該國際標(biāo)準(zhǔn)品得到國際上的普遍認(rèn)可，廣泛用于標(biāo)化布魯氏菌病的凝集試驗(yàn)。因此，以該國際標(biāo)準(zhǔn)品為溯源制備一批國家標(biāo)準(zhǔn)品，對解決我國布魯氏菌病血清學(xué)診斷中的實(shí)際問題具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)即是以VLA獲得的牛布魯氏菌病陽性血清國際標(biāo)準(zhǔn)品[8]為溯源，建立一批國家級標(biāo)準(zhǔn)品，用于標(biāo)定牛布魯氏菌病凝集試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和耗材

牛布魯氏菌病陽性血清國際標(biāo)準(zhǔn)品：從英國衛(wèi)橋 VLA-OIE布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室獲得，批號為N/A，1 000 IU/mL，標(biāo)化虎紅平板凝集試驗(yàn) (RBT)、試管凝集試驗(yàn) (SAT) 和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) (CFT) 預(yù)期滴度分別為 1/47.5、2/650和 2/200；牛布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)用抗原：購自英國 Central Veterinary Laboratory (CVL)，產(chǎn)品編號為PA0060，批號為 270；牛布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)用抗原：由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備，產(chǎn)品編號為200801，工作濃度為1∶20；牛布魯氏菌病補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)用抗原：購自英國 CVL，產(chǎn)品編號為 0066/03，批號為10，工作濃度1∶10；96孔U型底微量反應(yīng)板：購自GREINER公司。

1.2 候選物的制備

黑龍江省某農(nóng)場田間自然感染牛布魯氏菌病的奶牛4頭，以頸動脈采血法采血于無菌的大量筒中，置20 ℃左右4 h，待血液凝固后每個(gè)盛血量筒無菌操作加壓銅。靜置，待血清析出后，取上清，4 000 r/min離心20 min分離血清。

1.3 候選物篩選

以英國衛(wèi)橋 (VLA) 牛布魯氏菌病陽性血清國際標(biāo)準(zhǔn)品為參比，按文獻(xiàn)方法[9-11]分別測定 RBT、SAT和CFT效價(jià)。

1.4 分裝、凍干、熔封

將符合要求的候選物先經(jīng)0.4 μm無菌濾膜加壓過濾，再經(jīng)0.22 μm無菌濾膜加壓過濾；隨后用瓶頸分液器 (分裝精度為±0.01 mL) 無菌分裝至1 mL滅菌長安瓿，按常規(guī)方法凍干后抽真空、熔封。

1.5 成品檢驗(yàn)

1.5.1 物理性狀

隨機(jī)抽取 5支樣品，觀察顏色和形狀，再打開安瓿加去離子水 (可以低速渦旋或用移液器輕輕吹打)，記錄溶解情況。

1.5.2 無菌檢驗(yàn)、真空度測定、剩余水分測定

隨機(jī)抽取規(guī)定數(shù)量的樣品，按文獻(xiàn)方法[9-10]進(jìn)行。

1.5.3 效價(jià)測定

隨機(jī)抽取規(guī)定數(shù)量的樣品以英國衛(wèi)橋 (VLA)牛布魯氏菌病陽性血清國際標(biāo)準(zhǔn)品為參比，按文獻(xiàn)方法[9-11]分別測定RBT、SAT和CFT效價(jià)。

1.5.4 均勻性檢驗(yàn)

隨機(jī)抽取規(guī)定[12]數(shù)量的樣品，用國際標(biāo)準(zhǔn)品為參比按文獻(xiàn)方法[9-11]分別測定 RBT、SAT和 CFT效價(jià)。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)[13]

隨機(jī)選取規(guī)定數(shù)量的樣品分別放56 ℃、37 ℃和 25 ℃溫箱在規(guī)定時(shí)間取樣品分別進(jìn)行 CFT和SAT試驗(yàn)測定其效價(jià)。

1.5.6 協(xié)作標(biāo)定

組織 4家協(xié)作標(biāo)定單位按統(tǒng)一的協(xié)作標(biāo)定方案，以國際標(biāo)準(zhǔn)品為參比測定其RBT、SAT和CFT效價(jià)，試驗(yàn)完成后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[14]，確定待檢國家標(biāo)準(zhǔn)品國際單位含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選物篩選

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4份血清的RBT效價(jià)、SAT效價(jià) (表1) 和CFT效價(jià) (表2) 均為牛布魯氏菌病陽性，而且3#血清的效價(jià)最高。所以選擇3#血清作為制備牛布魯氏菌病陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的原材料。

表1 候選物篩選試管凝集效價(jià)測定結(jié)果Table 1 SAT titers of the selected candidates

表2 候選物篩選補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)效價(jià)測定結(jié)果Table 2 CFT titers of the selected candidates

2.2 成品檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 物理性狀

所有凍干陽性血清為淡黃色疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，溶解后為淡黃色澄明液體。

2.2.2 無菌檢驗(yàn)、真空度測定和剩余水分測定

無菌檢驗(yàn)和真空度測定結(jié)果均符合規(guī)定，剩余水分測定結(jié)果分別為2.8%、2.9%、2.4%和2.4%，均低于4%，符合要求。

2.2.3 效價(jià)測定

隨機(jī)選取5支凍干血清測定其RBT、SAT和CFT效價(jià)分別為 1∶160“+”、1∶2 400“++”、1∶800“++”。

2.2.4 均勻性檢驗(yàn)

隨機(jī)選取15支凍干血清測定其 RBT、SAT和CFT效價(jià)分別為1∶160“+”、1∶2 400“++”、1∶800“++”，說明該凍干血清的均勻性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表3，凍干血清56 ℃溫箱保存3周時(shí)其CFT和SAT效價(jià)開始逐漸下降，37 ℃溫箱保存8周時(shí)其CFT和SAT效價(jià)開始逐漸下降，25 ℃溫箱保存9周時(shí)其CFT和SAT效價(jià)開始逐漸下降。

表3 成品檢驗(yàn)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Product test results of stability test

2.2.6 協(xié)作標(biāo)定

匯總四家協(xié)作標(biāo)定單位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以國際標(biāo)準(zhǔn)品為參比測得該牛布魯氏菌病陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的CFT效價(jià)均為1∶800“++”、SAT效價(jià)均為1∶2 400“++”、RBT效價(jià)均為1∶160“+”，該標(biāo)定結(jié)果與研制該國家標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)標(biāo)定的結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)按照 WHO的要求[15]和國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范[16]中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備程序以國際標(biāo)準(zhǔn)血清為參比研制國家標(biāo)準(zhǔn)品。為提高產(chǎn)品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采取了以下措施：一是對國家標(biāo)準(zhǔn)品的候選物進(jìn)行篩選，盡量保證候選物的質(zhì)量；二是以國際標(biāo)準(zhǔn)血清為參比測定凍干血清的RBT、SAT和CFT效價(jià)，盡量準(zhǔn)確測定血清的效價(jià)；三是對凍干血清進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)，保證了凍干血清的均勻性；四是對凍干血清進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，提供了其保存期監(jiān)測數(shù)據(jù)；五是組織協(xié)作標(biāo)定，對不同協(xié)作標(biāo)定單位的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終以國際標(biāo)準(zhǔn)品為溯源確定了國家標(biāo)準(zhǔn)品的國際單位為4 000 IU/mL，保證了其實(shí)際使用中的國際統(tǒng)一性。

該國家標(biāo)準(zhǔn)血清可用于以下方式來標(biāo)化牛布魯氏菌病凝集試驗(yàn)，即標(biāo)化抗原：由于該標(biāo)準(zhǔn)血清在當(dāng)?shù)卦囼?yàn)條件下補(bǔ)體結(jié)合效價(jià)、虎紅平板凝集和試管凝集效價(jià)均已明確。隨后批次的牛布魯氏菌病補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)用抗原、虎紅平板凝集試驗(yàn)用抗原和試管凝集試驗(yàn)用抗原的最終滴度應(yīng)當(dāng)以該國家標(biāo)準(zhǔn)陽性血清來檢測；常規(guī)試驗(yàn)的對照：為了檢測結(jié)果可信，試驗(yàn)條件保持不變，每批牛布魯氏菌病凝集試驗(yàn)都應(yīng)以該標(biāo)準(zhǔn)品為參比進(jìn)行滴度測定；結(jié)果表達(dá)：由于試驗(yàn)體系中各種變量同時(shí)影響標(biāo)準(zhǔn)血清和被檢血清的效價(jià)，所以以國際單位表達(dá)結(jié)果不依賴于所采用的特殊試驗(yàn)體系。因此在每個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行牛布魯氏菌病凝集試驗(yàn)獲得的結(jié)果可以以一種有效的方式進(jìn)行比較。

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Preparation and characterization of follwing the national standard anti-Brucella abortus serum, bovine

Cui Li, Fushi Guan, Zhihong Dai, Hui Jiang, Fang Wen, Lianshou Lu, and Zaishi Wang

China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China

To prepare anti-Brucella abortus serum used for calibrate the agglutination test follwing the national standard, 4 anti-Brucella abortus sera were obtained from 4 cows infected with Brucella abortus naturally. By potency testing, the third serum was selected. Sterility, vaccum degree, residual moisture, uniformity and stability of this standard material were tested and proved to meet the national standard. Referring to the international standard, RBT (Rose-Bengal plate agglutination test), SAT (standard tube agglutination) and CFT (complement fixation test) titers of this standard material were measured to be 1:160 “+”, 1:2 400 “++” and 1:800 “++”, which are identical with the collaborative assay results. International unit of the standard material is 4 000 IU/mL.

Brucella abortus, anti-serum, the national standard, potency standardization, homogeneity, stability

牛布魯氏菌病通常由牛型布魯氏菌 (前稱流產(chǎn)布魯氏菌) 引起，其感染呈全球趨勢，給世界上很多國家和地區(qū)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。世界動物衛(wèi)生組織 (Office International Des Epizooties，OIE) 將其列為B類動物傳染病。

January 20, 2011; Accepted: April 8, 2010

Supported by: Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2006BAD06A10).

Zaishi Wang. Tel: +86-10-62103670; Fax: +86-10-62103671; E-mail: wangzaishi@ivdc.gov.cn

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃 (No. 2006BAD06A10) 資助。