狂犬病病毒抗體膠體金檢測試紙的制備

王鐵成，張濤，楊松濤，王化磊，高玉偉，孫瑋，靳曉霞，趙平森，馮娜，黃耕，鄒嘯環(huán)，夏咸柱

1 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，長春 130122

2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物研究所，北京 100021

3 吉林大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬，外形呈子彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內(nèi)含有單鏈 RNA，是引起狂犬病的病原體[1]。狂犬病對人生命安全的危害非常嚴(yán)重，一旦狂犬病發(fā)作，尚無法醫(yī)治[2]。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心 (CDC) 統(tǒng)計，2000-2006年全國共報告狂犬病病例13 104，僅2006年全年發(fā)病人數(shù)就達(dá)達(dá)3 385例。多數(shù)病例由犬、貓等帶毒動物傳染。預(yù)防狂犬病的發(fā)生，最有效的方法是對動物進(jìn)行狂犬病疫苗的免疫接種。按照世界衛(wèi)生組織 (WHO) 及國際獸疫局 (OIE) 的要求，人或動物接種狂犬病疫苗后，其血清 RV中和抗體效價大于0.5 IU/mL時，才能達(dá)到有效保護(hù)作用，否則應(yīng)予加強免疫，直至達(dá)到保護(hù)水平[3-4]。免疫過程中，由多種因素可能使機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體達(dá)不到保護(hù)水平，因此，對狂犬病的預(yù)防及抗體水平監(jiān)測顯得尤為重要。檢測狂犬病病毒血清的方法主要有小鼠血清中和試驗(NMT)[5-6]、快速熒光灶抑制試驗 (RFFIT)[7]、熒光抗體病毒中和試驗(FAVNT) 等，但均需要較長時間和專業(yè)技術(shù)人員操作，不利于臨床快速檢測。膠體金免疫層析技術(shù)近年來在生物各領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用。其優(yōu)點包括特異、快速、便捷、不需專業(yè)技術(shù)人員操作和貴重儀器設(shè)備等，特別適合臨床現(xiàn)場檢測。本試驗制備的狂犬病病毒抗體膠體金檢測試紙條，為注射RV疫苗后的犬的抗體水平監(jiān)測提供了便捷的方法，該試紙條具有較高的特異性、敏感性，而且操作簡單，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本、抗原及抗體

犬 RV陽性血清樣本由吉林省公安廳警犬基地(趙德江警官) 提供、農(nóng)業(yè)部狂犬病及野生動物與人共患傳染病診斷實驗室涂長春研究員惠贈、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所秦川教授惠贈；狂犬病病毒 (CVS11) 由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所唐青研究員惠贈，純化的兔抗RV IgG由本室制備；SPA為以色列Megapharm公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

瓊脂糖凝膠 4FF (Sepharose 4FF層析柱填料)柱、Protein G柱為GE公司產(chǎn)品；EDTA購自聯(lián)星生物公司；β-丙內(nèi)酯、吐溫-20購自上海西寶生物有限公司；二水合檸檬酸三鈉購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氯金酸 (HAuCl4·4H2O) 為Sigma產(chǎn)品；牛血清白蛋白 (BSA) 為Jackson產(chǎn)品；硝酸纖維素膜 (NC膜)、玻璃纖維、吸水紙、背板購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

XYZ3000 Dispensing Platform和CM4000 Cutter為美國Bio-Dot產(chǎn)品；UV-2800紫外分光光度劑購自Sigma公司；Thermo electron corporation D37520 Osterode離心機(jī)購自德國；90-2型定時控溫磁力攪拌器購自金壇市大地自動化儀器廠；電腦紫外檢測儀購自上海青浦滬西儀器廠；低溫真空干燥箱購自上海一恒科技有限公司。

1.2 狂犬病毒的純化

收獲Vero細(xì)胞培養(yǎng)84 h的狂犬病毒CVS11株上清，4 ℃、380×g離心30 min，取上清，按照β-丙內(nèi)酯與上清 1∶4 000 (V/V) 的比例滅活狂犬病病毒；1 mol/L醋酸鋅與滅活的狂犬病病毒液按1∶50 (V/V) 比例沉淀病毒，邊加邊攪拌，4 ℃沉淀2 h以上；4 ℃、400×g離心30 min，去上清，沉淀用飽和EDTA懸浮至澄清，過Sepharose 4FF層析柱，收集第1峰；將純化的病毒過Protein G柱，以去除培養(yǎng)病毒過程中的 IgG，4 ℃保存?zhèn)溆肹8-9]。以上試驗操作均在生物安全三級實驗室中進(jìn)行。

1.3 兔抗RV IgG純化

用純化的狂犬病毒按常規(guī)方法免疫家兔后，收集血清；用硫酸銨方法進(jìn)行純化，用0.01 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖液 (PB) 透析，?20 ℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.4 膠體金制備

用檸檬酸三鈉法制備20 nm的膠體金。用控溫磁力攪拌器將100 mL 0.01%氯金酸水溶液加熱至沸騰，迅速加入1.5 mL新配制的檸檬酸溶液，邊加邊攪拌，溶液由淡黃色變?yōu)樯詈稚?，加熱至顏色穩(wěn)定變?yōu)樽霞t色后，自然冷卻至室溫，保存?zhèn)溆?。此次制備的膠體金溶液其可見光吸收峰在 522 nm處的值為1.38[11]。

1.5 最小蛋白含量測定及標(biāo)記

取 8孔聚苯乙烯微量反應(yīng)管一條，各孔先加30 μL二餾水，再向第1孔內(nèi)加入30 μL純化的狂犬病病毒，倍比稀釋至最后一孔，向各孔加入125 μL pH 8.0的膠體金溶液，室溫靜置15 min；向各孔加入125 μL 10% NaCl溶液，觀察各孔顏色變化，以不變色一孔為最小蛋白濃度；按測得的最小蛋白濃度的比例將純化的狂犬病毒加至pH 8.0的膠體金溶液中，邊加邊攪拌，室溫靜置30 min；加入10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在溶液中的終濃度為1%，室溫靜置15 min；4 ℃、8 778×g離心30 min，吸去上清，用重懸液Ⅰ (含BSA等) 懸浮至原體積，4 ℃、8 778×g離心30 min，去上清，沉淀用重懸液Ⅱ (含蔗糖、BSA、吐溫-20等) 1/5體積懸起，4 ℃保存?zhèn)溆肹12-13]。

1.5.1 試紙條T線包被濃度的確定

用濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的SPA分別噴于NC膜的T處，C線噴純化的兔抗RV，濃度為0.8 mg/mL。

1.5.2 金標(biāo)墊、樣品墊預(yù)處理

將含BSA、蔗糖的溶液和含吐溫-20、PEG20 000的溶液分別噴于玻璃纖維處，作為試紙條的金標(biāo)墊和樣品墊，將玻璃纖維置于42 ℃熱空氣消毒箱中烘干2 h以上，待完全烘干后，密封備用。

1.6 試紙的組裝及檢測

1.6.1 試紙的組裝

將已確定T線和C線濃度的SPA和兔抗RV IgG的NC膜、金標(biāo)墊 (結(jié)合釋放墊，標(biāo)記CVS11的膠體金已按確定濃度低溫干燥其上)、樣品墊、吸水紙按順序粘于背板上，按所需寬度切割后，安放于塑料卡內(nèi)，密封保存?zhèn)溆肹14]。

1.6.2 試紙條結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

在T和C處出現(xiàn)紫紅色線和淺紫紅色線分別判為陽性和弱陽性；在T出未出現(xiàn)色線而只在C出現(xiàn)紅線判為陰性；在C處未出現(xiàn)紫紅色線，則判定試紙條無效。

1.6.3 試紙條特異性檢測

用制備的檢測試紙條分別用犬瘟熱病毒(CDV) 陽性血清、細(xì)小病毒 (CPV) 陽性血清、犬腺病毒 (CAV) 犬陽性血清、犬標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、犬RV陽性血清 (VNT＞0.5 IU) 進(jìn)行檢測。

1.6.4 試紙條靈敏度檢測

用試紙條對68份陽性樣品 (VNT≥1.0 IU/mL)、16份弱陽性樣品 (0.5 IU/mL≤VNT＜1.0 IU/mL)和5份標(biāo)準(zhǔn)陰性犬血清進(jìn)行檢測。

1.6.5 試紙條穩(wěn)定性檢測

分別于常溫和4 ℃保存制備的檢測試紙，經(jīng)過3、6、12個月后檢測已知犬RV陽性和陰性血清，與最初制備時的結(jié)果比較。

1.6.6 試紙條對比試驗

RFFIT是世界衛(wèi)生組織及世界動物衛(wèi)生組織推薦的用于狂犬病抗體檢測的方法，因此本試紙檢測選用 RFFIT進(jìn)行結(jié)果對比。選用狂犬病病毒(VNT≥1.0 IU/mL)、(0.5 IU/mL≤VNT)，分別用RFFIT法和試紙條法進(jìn)行檢測，并進(jìn)行結(jié)果對比。

1.7 試紙條臨床應(yīng)用

對吉林省公安廳警犬基地惠贈的12份、農(nóng)業(yè)部狂犬病及野生動物與人共患傳染病診斷實驗室的105份、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所惠贈的 3份 RV疫苗免疫的犬血清樣本，以及軍事獸醫(yī)研究所收集的犬141份RV免疫血清樣本進(jìn)行檢測，同時用FAVN方法進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金制備及標(biāo)記結(jié)果和分析

電鏡下，制備的膠體金較均一、分散；膠體金與純化的狂犬病病毒結(jié)合穩(wěn)定。將制備的金標(biāo)記狂犬病毒4 ℃放置10 d后，未見膠體金結(jié)合物有明顯變化，如果制備的膠體金顆粒電鏡下聚集在一起，標(biāo)記后的膠體金通常放置2 d以上就會在保存管底部出現(xiàn)金沉淀，這樣會對試紙的保存期和靈敏性產(chǎn)生影響。若要制備均勻、分散的膠體金顆粒，在操作時一定要迅速加入檸檬酸三鈉溶液，而且要不斷攪勻，如圖1~2所示。

圖1 電鏡下的膠體金 (20 000×)Fig. 1 Colloidal gold particle by electron microscope (20 000×).

圖2 電鏡下的金標(biāo)狂犬病毒 (20 000×)Fig. 2 Rabies virus labeled with gold (20 000×).

2.2 試紙條T線包被濃度的確定

選用濃度為1.5 mg/mL的SPA包被T線，0.5、1.0 mg/mL的SPA檢測時顯色偏弱，選用濃度為2.0 mg/mL的SPA容易出現(xiàn)非特異性結(jié)果。

2.3 試紙條特異性檢測結(jié)果

對已知犬CDV、CPV、CAV陽性血清和犬RV標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行檢測結(jié)果為陰性，見圖 3；對犬RV陽性血清 (VNT＞0.5 IU) 檢測結(jié)果為陽性。

2.4 試紙條靈敏性檢測

隨著犬 RV血清效價的高低，檢測線顯色由深變淺；0.5 IU以下的血清結(jié)果為陰性，如圖4所示。

2.5 試紙條穩(wěn)定性檢測結(jié)果

試紙在不同環(huán)境下保存 3、6、12個月時對已知效價的 RV陽性和陰性血清進(jìn)行檢測與最初檢測結(jié)果對比，未見明顯差異，故該試紙有效期至少12個月。

2.6 試紙條對比試驗結(jié)果

膠體金檢測試紙對0.5 IU以上的犬陽性血清均能顯示陽性結(jié)果，低于0.5 IU則只出現(xiàn)陰性結(jié)果靈敏度略低于RFFIT (圖5)，RFFIT檢測0.5 IU以下的犬RV陽性血清仍能看到較清晰的熒光。

2.7 試紙條臨床應(yīng)用結(jié)果

對吉林省公安廳警犬基地、農(nóng)業(yè)部狂犬病及野生動物與人共患傳染病診斷實驗室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所從全國各省市收集免疫 RV疫苗的犬血清以及軍事獸醫(yī)研究所收集的犬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果與FAVN方法檢測的符合率為98%，其中118為陽性血清，5份疑似陽性，43份陰性。疑似陽性結(jié)果均為血清效價較低 (低于0.5 IU)，試紙檢測較長時間T線處才出現(xiàn)一很弱色線，所以結(jié)果判定為疑似陽性。

圖3 試紙條特異性檢測結(jié)果Fig. 3 Specificity of the immunochromatographic strip. CDV: canine distemper virus antibody; CPV: canine parvovirus antibody; CAV: canine adenovirus antibody.

圖4 試紙條靈敏度檢測結(jié)果Fig. 4 Sensitivity of the immunochromatographic strip.

圖5 試紙條對比試驗結(jié)果Fig. 5 Results of contrast test.

3 討論

本試驗選用醋酸鋅方法沉淀狂犬病病毒，沉淀樣本選用的是接種狂犬病病毒細(xì)胞的上清液，保證了收獲的狂犬病毒多數(shù)為裝配完整的病毒粒子，同時純化后經(jīng)電鏡觀察驗證RV病毒粒子完整。選用CVS11標(biāo)準(zhǔn)毒作為標(biāo)記蛋白，病毒粒子表面的糖蛋白未被破壞，能夠與RV中和抗體有效發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，從而避免了純化狂犬病病毒糖蛋白的繁瑣工作，而且用完整病毒粒子標(biāo)記的膠體金，在檢測免疫 RV疫苗的犬產(chǎn)生中和抗體的過程中，驗證了其結(jié)果的正確性和可行性。筆者在開始試驗過程中，未對純化病毒進(jìn)行處理，直接作為標(biāo)記蛋白，在試紙條使用過程中出現(xiàn)非特異現(xiàn)象，給試驗帶來了影響。后經(jīng)分析，試紙的檢測線為SPA，其可與多種動物血清中的IgG Fc片段結(jié)合[16]，在培養(yǎng)狂犬病病毒過程中使用的是小牛血清，產(chǎn)生的非特異極可能是病毒粒子中未除去的牛血清中的IgG造成的，將病毒過Protein G柱后，再重新標(biāo)記，制備檢測試紙，對犬 RV標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果去除了非特異現(xiàn)象。用SDS-PAGE對病毒進(jìn)行檢測，可見一極弱與分子量相當(dāng)?shù)腎gG條帶，證實純化后的RV病毒中含有少量小牛血清中的IgG。

試紙條樣品墊和金標(biāo)墊的預(yù)處理也十分重要。本試驗樣品墊中包含 PEG20 000，其無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，并具有優(yōu)良的保濕性、粘接劑、抗靜電等特點。但其用量過大也易出現(xiàn)假陽性，控制其用量能夠起到增加試紙靈敏性的作用[17]。在金標(biāo)墊 (結(jié)合釋放墊) 中我們加入了蔗糖，因其具有極好的水溶性，因而能夠使標(biāo)記的膠體金完全釋放出來使反應(yīng)更能充分進(jìn)行，同時在金標(biāo)墊處中的BSA能夠有效保護(hù)標(biāo)記抗原，延長了試紙的有效期。

在驗證農(nóng)業(yè)部狂犬病野生動物及人共患病實驗室、吉林省公安廳警犬基地及中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究等單位收集的免疫狂犬病毒疫苗的犬血清實驗中，與FAVN試驗結(jié)果進(jìn)行對比，符合率可達(dá)98%以上。

我國的狂犬病發(fā)病情況依然嚴(yán)重，在用狂犬病毒疫苗免疫犬等動物過程中，常出現(xiàn)動物機(jī)體產(chǎn)生的抗體滴度不高或不產(chǎn)生抗體，起不到免疫保護(hù)的作用，出現(xiàn)這種情況的原因可能有以下幾種，疫苗保存不當(dāng)而失效、動物個體原因、飼養(yǎng)環(huán)境等因素，這就對動物和人形成了潛在的危險，因此對犬等動物免疫狂犬病毒疫苗后的抗體滴度進(jìn)行及時監(jiān)測顯得特別重要[18]。但通常的檢測方法需要專門的實驗設(shè)備和技術(shù)人員操作，而且一般需要幾天或更長時間才能出結(jié)果，不適合臨床的快速診斷。膠體金檢測試紙能在20 min內(nèi)得出確定結(jié)果，且特異性、敏感性、穩(wěn)定性較高，尤其適用于臨床大批量樣品檢測。

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