熱休克蛋白HSP70和gp96增強乙肝DNA疫苗的細胞和體液免疫應答

王彥中，王賽鋒，張小俊，李楊，趙世宇，孟頌東

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2 中國科學院研究生院，北京 100049

3 北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100024

目前世界上有 20億人被乙肝病毒 (HBV) 感染，3.7億患者轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥?，每年?00萬人死于乙肝引發(fā)的肝癌[1]。在我國有大約9 300萬乙肝病毒攜帶者，3 000萬乙肝患者。慢性乙肝病毒感染的治療方案包括干擾素IFN-α-2b、PEG-IFN-α-2a，以及核苷類似物藥物如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋。其中拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋為逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，而IFN-α-2b和PEG-IFN-α-2a則抑制病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄和增強免疫系統(tǒng)功能。這些藥物只對部分患者有療效，且不能有效地清除病毒cccDNA，長時間用藥可能導致病毒耐藥，使得療效降低[2-3]。

臨床資料提示HBV特異性免疫，特別是T細胞免疫在病毒的清除中發(fā)揮關鍵作用。在急性乙肝患者中可以檢測到較強的、多克隆的乙肝特異性T細胞應答，但是在慢性肝炎患者中僅能檢測到較弱的、寡克隆的免疫應答，因此乙肝特異性T細胞應答不足是導致病毒無法清除、感染慢性化的決定因素之一。乙肝治療性疫苗通過設計HBV特有抗原，并利用生物技術增強其免疫原性，有效激活乙肝攜帶者或慢性乙肝患者T細胞免疫和體液免疫，打破免疫耐受，有效抑制和清除病毒，達到治療的目的。研制乙肝治療性疫苗可有效補充目前的抗病毒治療。

目前已經(jīng)設計出的乙肝治療性疫苗包括蛋白疫苗、表位多肽疫苗以及DNA或病毒載體疫苗，并通過臨床試驗檢驗其療效[4]。蛋白或多肽疫苗易降解，作用時間短，相比之下以DNA為基礎的疫苗在體內(nèi)可以較長時間表達抗原基因[5]，而且DNA疫苗能更有效地激活細胞免疫，這在乙肝免疫治療中有重要意義[6-7]。目前乙肝治療性DNA疫苗已經(jīng)進入臨床Ⅰ、Ⅱ期，主要有法國巴斯德所研發(fā)的pCMV-S2.S表達載體作為DNA疫苗編碼和表達HBV表面蛋白S和M (包含S和preS2) 蛋白，韓國浦項 (Pohang)科技大學開發(fā)HB100 DNA疫苗 (包括5個載體：pGX10 S、pGX10 S1/S2/X、pGX10 core、pGX10 Pol、pGX10 hIL-12)，以及表達HBsAg的安卡拉痘病毒(MVA) 疫苗等[4]。

熱休克蛋白gp96和HSP70作為分子伴侶，可結(jié)合腫瘤或病原微生物特異抗原，并將抗原呈遞給MHCⅠ類分子和Ⅱ類分子，激活腫瘤或病原特異性 T細胞，同時與 Toll樣受體相互作用激活天然免疫[8-10]。本課題組首次從乙型肝炎病毒感染肝癌患者的肝組織中分離鑒定了與 gp96結(jié)合的天然抗原多肽，發(fā)現(xiàn)gp96能有效促進DC細胞成熟，激活特異性CTL和Th1型細胞[11-13]。因此，HSPs與其結(jié)合的抗原肽復合物是迄今發(fā)現(xiàn)的最為理想的、啟動特異性免疫應答的天然多價抗原。HBsAg、HBcAg特異性T細胞對于控制感染和清除乙肝病毒至關重要，而 DNA疫苗主要作用機制是激活細胞免疫，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，將HBsAg與HBcAg聯(lián)合免疫和 HBsAg單獨免疫相比，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的抗HBsAg的抗體水平，特別是特異性T細胞免疫水平，聯(lián)合免疫的方式明顯高于HBsAg單獨免疫的水平，提示HBcAg本身對HBsAg有免疫增強作用 (數(shù)據(jù)待發(fā)表)，這可能由于HBcAg獨特的20面體的類似VLP結(jié)構(gòu)，在此基礎上我們設計 HBsAg/HBcAg DNA疫苗，以gp96和HSP70為免疫佐劑，進一步提高T細胞免疫應答，為設計新型乙肝治療性疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

小鼠肥大細胞瘤系 P815由本實驗室傳代、保存。用HBsAg和HBcAg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P815細胞以表達HBV抗原 (HBsAg和HBcAg)，經(jīng)G418篩選，鑒定獲得穩(wěn)定表達HBsAg和HBcAg的細胞株。P815細胞株均采用DMEM+10%FCS+青鏈霉素+G418于37 ℃、5% CO2孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒載體

本實驗所用真核表達載體均構(gòu)建于pcDNA3.1(+) (Invitrogen)，包括pcDNA3.1-HbsAg、pcDNA3.1-HbcAg、pcDNA3.1-gp96、pcDNA3.1-HSP70。pcDNA3.1-HBsAg、pcDNA3.1-HBcAg、pcDNA3.1-gp96由本實驗室保存。HSP70的序列由中國科學院微生物研究所葉昕研究員饋贈。以PCR從 pCMV-HSP70得到 HSP70序列并在兩端引入BamH I和Xho I位點 (下劃線所示)，經(jīng)雙酶切克隆于pcDNA3.1(+)。上下游引物 (5′?3′) 各是：GCGG ATCC ATGTCGGTGGTGGGCATAGACC (forward)，GCGCTCGAGTCAATCAATGTCCATTTCAGGAAG C (reverse)。所有載體都經(jīng)過雙酶切和DNA測序進行鑒定。所有載體在大腸桿菌 DH5α中擴增，按產(chǎn)品說明提取和純化質(zhì)粒，去除內(nèi)毒素RNA和蛋白的污染 (威格拉斯生物技術有限公司，北京)。

1.3 蛋白免疫印記

蛋白免疫印記鑒定真核表達載體 pcDNA3.1-gp96和pcDNA3.1-HSP70在P815細胞系中的表達。按照脂質(zhì)體 (Invitrogen，Carlsbad，CA，USA) 標準轉(zhuǎn)染程序轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-gp96和 pcDNA3.1-HSP70，以空載體和未轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)染 48 h后收集細胞提取蛋白。10% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印于PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉1 h，一抗 (1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，以PBST洗3次，每次 10 min，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000) 室溫孵育1 h，同樣步驟用PBST洗去二抗后加顯色液曝光顯影。

1.4 小鼠免疫

雌性BALB/c小鼠(H-2d) (6~8周) 購于北京維通利華實驗動物有限公司，在北京大學醫(yī)學院實驗動物中心SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。實驗分為6組，每組12只小鼠，分別是gp96+HBsAg+HBcAg (50 μg+ 50 μg+50 μg/只)，HSP70+HBsAg+HBcAg (50 μg+ 50 μg+50 μg/只)，HBsAg+HBcAg (50 μg+50 μg/只)，gp96+pcDNA3.1 (50 μg+100 μg/只)，HSP70+pcDNA3.1 (50 μg+100 μg/只)，pcDNA3.1 (100 μg/只)。免疫前3天在小鼠后肢肌內(nèi)注射利多卡因 (100 μL，0.25% (V/V)) 進行麻醉，然后在同樣的部位肌內(nèi)注射無菌PBS稀釋的質(zhì)粒DNA，每只200 μL。第1次免疫后的第7天和21天進行兩次加強免疫。第1次免疫前第1次采血，以后隔周采血收集血清樣品。體液免疫指標 (每組6只小鼠) 在第1次免疫后跟蹤檢測8周。最后1次免疫結(jié)束后5 d處死小鼠，體外刺激3 d后檢測細胞免疫學指標 (每組6只小鼠)。

1.5 酶聯(lián)免疫斑點實驗

使用 ELISPOT (Enzyme linked immunospot assay) (BD-Pharmingen，San Diego，CA) 檢測HBsAg和HBcAg激活特異的T細胞分泌IFN-γ的能力。實驗分為6組，每組6只小鼠。每只小鼠再分別做陰性孔、陽性孔和實驗孔。我們以P815空細胞和BSA為陰性孔，以PHA刺激為陽性孔，每只小鼠做3個復孔，加入P815穩(wěn)定株作為實驗孔。

使用Anti-IFN-γ包被96孔板，4 ℃過夜，次日用無菌PBS清洗5次，再以含10% FCS的RPMI 1640封閉2 h，棄去培養(yǎng)基加入抗原刺激物和IL-2，然后按照 1×106細胞/孔加入淋巴細胞，終體積為200 μL。在37 ℃、5% CO2中孵育24 h，去離子水4 ℃裂解細胞10 min，PBST洗5次，加入檢測抗體，室溫孵育2 h，PBST洗5次，然后加入酶聯(lián)親和素，室溫孵育1 h，PBST洗5次，后加入顯色液顯色。充分干燥后用熒光酶聯(lián)斑點分析儀 (Biosys，Germany) 計數(shù)。讀出的斑點數(shù)減去陰性對照的斑點數(shù)即為淋巴細胞特異刺激條件下分泌IFN-γ斑點數(shù)。

1.6 細胞內(nèi)因子染色

以流式細胞內(nèi)因子染色檢測小鼠CTL細胞的活化程度。按照 Cytofix/Cytoperm 試劑盒 (BDPharmingen，San Diego，CA) 的操作流程，取體外刺激3 d后的淋巴細胞 (3×106) 加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑和刺激物 (PMA+離子霉素) 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)6 h，收集細胞用含5% BSA的PBS封閉0.5 h，加入表面標志的標記單抗 (Percp-Cy5.5-CD3，PE-CD4，F(xiàn)ITC-CD8 (E Bioscience))，4 ℃避光孵育0.5 h，再用含5% BSA的PBS清洗2次，加入固定/破膜劑，4 ℃孵育20 min，然后用破膜/清洗劑清洗2次，然后在50 μL體系中加入胞內(nèi)細胞因子單抗 (APC-IFN-γ)，4 ℃避光孵育0.5 h，清洗劑清洗2次，用 5% BSA的 PBS重懸，用流式細胞儀(FACS Calibur；BectonDickinson，Mountain View，CA) 分析。

1.7 3H-TdR實驗

體外刺激后的淋巴細胞單細胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，以2×106/mL的密度鋪于96孔U-型板，每孔100 μL，再加入抗原刺激物。以15 μg/mL的HBsAg (北京天壇生物股份有限公司饋贈) 和 HBcAg (本室表達) 抗原刺激為實驗孔，以conA刺激為陽性對照、BSA 刺激為陰性對照。孵育3 d后，加入1 μCi的[3H]-脫氧胸苷 (Amersham，UK)，孵育過夜，然后收集細胞，用液體閃爍儀檢測[3H]-脫氧胸苷吸入量。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗方法 (ELISA) 方法用于鑒定穩(wěn)定表達HBsAg和HBcAg的質(zhì)粒構(gòu)建的P815穩(wěn)定細胞株，以及檢測免疫小鼠體內(nèi)的體液免疫水平。

質(zhì)粒表達的驗證：收集 P815細胞穩(wěn)定表達pcDNA3.1-HBsAg和pcDNA3.1-HBcAg的細胞株的總蛋白。以空載體和未轉(zhuǎn)染細胞為陰性對照。用ELISA試劑盒 (上?？迫A生物工程股份有限公司)檢測HBsAg的表達水平。用本實驗室保存的小鼠多抗鑒定HBcAg的表達水平。

小鼠的體液免疫水平的跟蹤檢測：用HBsAg蛋白包被平底96孔板 (8 μg/孔)，4 ℃孵育過夜，然后用PBST清洗3次，每次5 min，再用含5%脫脂牛奶的PBST封閉1 h，然后重新清洗3次，每次5 min，然后加入稀釋好的血清 (1∶2 000)，37 ℃孵育2 h，然后PBST清洗3次，分別加入過氧化物酶標記的抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a抗體，37 ℃孵育2 h，然后PBST清洗。加入顯色液顯色，反應用1 mol/L的硫酸終止，在490 nm讀吸光值。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒信息的正確性

本實驗使用的4種DNA質(zhì)粒 (包括pcDNA3.1-HBsAg、pcDNA3.1-HBcAg、pcDNA3.1-gp96和pcDNA3.1-HSP70) 都經(jīng)雙酶切和DNA測序驗證其序列的正確性。為了確保 pcDNA3.1-gp96和pcDNA3.1-HSP70載體能夠在細胞內(nèi)正確表達，我們以脂質(zhì)體將載體轉(zhuǎn)染P815細胞，以空載體和未轉(zhuǎn)染細胞作為陰性對照。48 h后通過蛋白免疫印跡鑒定基因的表達。而P815-HBsAg和P815-HBcAg穩(wěn)定株則使用 ELISA方法檢測細胞內(nèi) HBsAg和HBcAg蛋白的表達，以瞬時轉(zhuǎn)染空載體和 P815空細胞為陰性對照。實驗結(jié)果如圖 1所示，這些結(jié)果表明所有基因都正確表達。

2.2 gp96和 HSP70可以顯著增強乙肝特異性細胞免疫水平

通過ELISPOT、細胞內(nèi)IFN-γ染色和3H-脫氧胸苷摻入方法檢測CTL的活化，檢測gp96和HSP70在激活乙肝特異性細胞免疫的佐劑效果。ELISPOT的結(jié)果顯示，gp96和HSP70都能顯著地增加乙肝特異性淋巴細胞分泌 IFN-γ的水平 (圖 2)，與單獨使用DNA疫苗 (HBsAg/HBcAg) 免疫相比，聯(lián)合gp96免疫分別提高HBsAg和HBcAg特異性T細胞水平2.5倍 (P＜0.01) 和3.8倍 (P＜0.001)，HSP70分別提高特異性T細胞水平6.2倍 (P＜0.01) 和 1.3倍(P＜0.01)。同時，體外轉(zhuǎn)染實驗表明，與單獨轉(zhuǎn)染HBsAg/HBcAg相比，gp96或HSP70與抗原共同轉(zhuǎn)染293T細胞并未使抗原表達明顯發(fā)生變化，排除了gp96或HSP70通過改變HBsAg和HBcAg的表達影響免疫活性的可能性。

圖1 DNA載體的表達鑒定Fig. 1 Expression of gp96, HSP70, HBsAg and HBcAg in P815 cells. (A) Western blotting analysis to characterize the expression of plasmid pcDNA-gp96 and pcDNA-HSP70. P815 cells were transfected with pcDNA-gp96 or pcDNA-HSP70, or the empty vector pcDNA or no vector as control. 48 h after transfection, cells were harvested, and cell lysates were immunoblotted with an anti-gp96 or anti-HSP70 Ab. β-actin was used as the loading control. (B) ELISA analysis to characterize the expression of HBsAg or HBcAg in stably transfected cells. Results were presented as from 3 independent experiments.

進一步通過細胞內(nèi) IFN-γ染色法檢測活化的 T細胞。如圖 3所示，與單獨使用 DNA疫苗(HBsAg/HBcAg) 免疫相比，聯(lián)合 gp96免疫分別提高IFN-γ+的CD8+T細胞水平1.37倍 (HBsAg刺激)和1.23倍 (HBcAg刺激)，提高IFN-γ+的CD4+T細胞水平1.47倍 (HBsAg刺激) 和1.70倍 (HBcAg刺激) (P＜0.001)。同樣，聯(lián)合 HSP70免疫分別提高IFN-γ+的CD8+T細胞水平1.36倍 (HBsAg刺激) 和1.44倍 (HBcAg刺激)，提高IFN-γ+的CD4+T細胞水平1.60倍 (HBsAg刺激) 和1.59倍 (HBcAg刺激) (P＜0.001)。

T細胞在特異抗原刺激下的增殖水平也是反映T細胞活性的指標之一。我們進一步檢測 T細胞的增殖能力，與單純抗原組 (sc組) 相比，聯(lián)合gp96和HSP70均能提高脾臟淋巴細胞的增殖，其中gp96分別提高脾臟淋巴細胞增殖能力 59% (HBsAg刺激) 和81% (HBcAg刺激)，而HSP70則分別提高31% (HBsAg刺激) 和64% (HBcAg刺激)。

2.3 gp96和 HSP70可以提高乙肝抗原的體液免疫水平

圖2 ELISPOT檢測HBsAg和HBcAg特異性T細胞Fig. 2 T-cell responses in immunized Balb/c mice were detected by ELISPOT assay. Mice were immunized with DNA constructs of gp96 and HBsAg/HBcAg (gp96+sc), HSP70 and HBsAg/HBcAg (HSP70+sc), HBsAg/HBcAg (sc), gp96 and pcDNA3.1 (gp96+pcDNA3.1), HSP70 and pcDNA3.1 (HSP70+pcDNA3.1), or pcDNA3.1 for three times with intramuscular (i.m.) injection. Mice were sacrificed on the fifth day after the last immunization and the splenocytes were collected for ELISPOT assay. The photograph of the representative wells from different immunization groups is shown (A). Data showed of six mice (B). ** P<0.01 compared with HBsAg/HBcAg DNA immunization (sc) only.

最后，我們檢測免疫后小鼠表面抗原抗體(anti-HBsAg) 的產(chǎn)生，通過ELISA檢測HBsAg特異的總IgG、IgG1和IgG2a的抗體滴度。各組小鼠跟蹤5次，結(jié)果如圖4所示。與單獨抗原免疫組 (sc組) 相比，免疫8周后gp96和HSP70聯(lián)合免疫組在總IgG和IgG2a水平上均有顯著提高 (20%~60%)，但是在IgG1水平上各組無顯著性差異。說明熱休克蛋白gp96和HSP70主要增強DNA疫苗的Th1型免疫應答 (IgG2a水平)。

3 討論

本研究對熱休克蛋白 gp96和 HSP70提高HBsAg/HBcAg DNA疫苗的免疫活性作了全面研究，通過ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)gp96和HSP70可提高抗原特異性 T細胞水平 1~6倍，提高 IFN-γ+的 T細胞水平1~2倍，同時HBsAg特異的IgG1和IgG2a的水平提高了 20%~60%。以上結(jié)果說明 gp96和HSP70可顯著提高乙肝DNA疫苗的細胞免疫和體液免疫應答，對細胞免疫的促進作用要優(yōu)于體液免疫。這與常用的佐劑如氫氧化鋁有很大的不同，氫氧化鋁佐劑主要提高抗體水平，但對細胞免疫應答影響有限。我們的結(jié)果顯示了熱休克蛋白 gp96和HSP70作為佐劑激活乙肝特異性細胞免疫的突出效果。

圖3 流式細胞術檢測分泌IFN-γ的CD8+和CD4+ T細胞Fig. 3 IFN-γ producing CD8+ and CD4+ T cells were detected by intracellular IFN-γ staining. (A) Flow cytometric analysis were performed for the presence of IFN-γ+ CD8+ and CD4+ T cells stimulated with HBsAg or HBcAg. (B) Data showed of six mice. ** P<0.01 by t test compared with HBsAg/HBcAg DNA immunization (sc) only.

圖4 ELISA方法檢測IgG、IgG1、IgG2a的水平Fig. 4 Humoral immune responses in Balb/c mice were measured by ELISA. Serum anti-HBsAg IgG (A), IgG1 (B), and IgG2a (C) antibody titers were detected by ELISA at one-week interval after the first immunization. IgG, IgG1 and IgG2a titers from 1:2 500, 1:2 000 and 1:2 000 dilution sera respectively. Data showed of six mice.*P<0.05; **P<0.01 by t test compared with HBsAg/HBcAg DNA immunization (sc) only. Data were representative of three independent experiments.

我們設計的DNA疫苗以HBV的兩種主要結(jié)構(gòu)蛋白HBsAg和HBcAg作為抗原，聯(lián)合熱休克蛋白免疫小鼠可顯著誘導病毒特異性 T細胞和抗體反應。目前以 HBsAg/HBcAg蛋白作為抗原研制乙肝治療性疫苗在古巴哈瓦那遺傳與生物技術中心已經(jīng)用于臨床，初步結(jié)果顯示疫苗安全可靠[4,14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白 gp96和 HSP70可進一步提高HBsAg/HBcAg抗原的免疫活性，更重要的是我們的結(jié)果表明與HBsAg相比，HBcAg在激活細胞免疫方面比HBsAg更有優(yōu)勢 (圖2、圖3)，這對于設計更有效的乙肝治療性疫苗有重要意義。

Th1型免疫會產(chǎn)生IgG2a抗體，Th2型免疫則產(chǎn)生IgG1抗體。實驗結(jié)果顯示熱休克蛋白在體液免疫方面主要提高了IgG2a的水平，而在IgG1水平上無明顯的作用，這與我們的T細胞檢測結(jié)果一致，說明熱休克蛋白主要激活Th1型免疫應答。

雖然已有的研究發(fā)現(xiàn)將 gp96基因片段與抗原DNA融合設計DNA疫苗能有效激活機體細胞免疫和體液免疫應答[13,16]，但基因的融合方式 (如 gp96基因片段的選取)、融合方向 (在C端或N端融合)等均會影響免疫效果，這使得gp96的DNA疫苗設計復雜化和存在不確定性。本研究證明單獨構(gòu)建HSP70和gp96表達載體與現(xiàn)有的HBV DNA疫苗聯(lián)合使用均可顯著提高疫苗的免疫活性，這為設計高效的乙肝治療性DNA疫苗提供了依據(jù)。

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