噬菌體展示HIV-1 Tat38-61堿性區(qū)51和55位隨機(jī)突變體文庫的構(gòu)建

葛宜兵，楊旭芳，杜哲明，龐強(qiáng)，曹潔，陳秋莉，王錦紅，張華群，廖文婷，祁培培，劉超，章萍萍，鄧松華，潘衛(wèi)

1 安徽醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，合肥 230032

2 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué) 微生物學(xué)教研室，上海 200433

3 武警江西總隊(duì)醫(yī)院外一科，南昌 330000

目前，艾滋病 (Human immunodeficiency virus，HIV) 已經(jīng)成為我國乃至全球所面臨的重大公共衛(wèi)生問題，研制有效的HIV疫苗是HIV防治的重要手段之一。人免疫缺陷病毒Ⅰ型 (Human immunodeficiency virus-1，HIV-1) 的反式激活蛋白Tat (Trans-activator of transcription) 是HIV復(fù)制早期產(chǎn)生的一種重要調(diào)控蛋白，在 HIV-1的復(fù)制、擴(kuò)散和致病中起重要作用[1-3]。Tat還可被感染細(xì)胞通過多種方式分泌到胞外發(fā)揮“病毒毒素”的作用：通過誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮其免疫抑制的作用[4-6]。HIV-1 Tat分子含有N端區(qū) (1~21aa)、半胱氨酸富集區(qū) (22~37aa)、核心區(qū) (38~48aa)、堿性氨基酸富集區(qū) (49~59aa)、谷氨酰胺富集區(qū)(60~72aa) 以及C端區(qū) (73~101aa) 6個(gè)功能區(qū)[7]。

堿性氨基酸富集區(qū) (49~59aa) 與 HIV RNA的轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)單元 (Transactivation response element，TAR) 結(jié)合，促進(jìn)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄，激活病毒復(fù)制[8]。該區(qū)域含有核定位序列 (Nuclear localization signal，NLS)，具有核轉(zhuǎn)位功能，此外，該區(qū)具有穿膜功能，是 Tat進(jìn)入旁觀者細(xì)胞和穿越血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9-10]，在卡波氏肉瘤[11]和艾滋病腦病[12]的發(fā)生中起重要作用。該序列在各亞型間高度保守，是序列中最保守的區(qū)域，同時(shí)堿性區(qū)還是Tat的主要中和表位之一，其抗體可完全消除Tat分子所特有的穿入其他細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用的核心功能[13]。目前，重組表達(dá)的具有生物學(xué)活性的全長Tat蛋白作為治療性疫苗已進(jìn)入臨床II期[14-15]。鑒于Tat分子的毒性作用，消除Tat生物學(xué)活性并保留其免疫原性是新型Tat疫苗研發(fā)的重要方向。通過對堿性區(qū)進(jìn)行突變消除其生物學(xué)活性是很好的選擇，有研究表明將 Tat全長 27、51、55、79位分別定點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸 (S)、蘇氨酸 (T)、亮氨酸 (L) 和丙氨酸 (A) 后，其生物學(xué)活性被大大減弱且免疫原性未受影響，但 51、55位的單獨(dú)突變體生物學(xué)活性減弱不明顯[16]。Tat 51、55位位于堿性區(qū)表位內(nèi)，并且其序列高度保守，幾乎不發(fā)生變異，如此保守的位點(diǎn)發(fā)生變異到底能否影響及如何影響其生物學(xué)活性及免疫原性尚未有系統(tǒng)的研究，為了回答這一問題，本研究對Tat(38-61) 51、55位分別進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建噬菌體展示 HIV-1 Tat38-61(51N/55N) 堿性區(qū)突變體庫，為應(yīng)用分子進(jìn)化的方法系統(tǒng)研究 51、55位突變對抗原性的影響，并以此為獲得可用作疫苗候選物的新型Tat突變體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

經(jīng)大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的編碼天然 HIV-1 HXB2株Tat蛋白的重組質(zhì)粒pET32a-Tat(1-101)、大腸桿菌E. coli TG1、質(zhì)粒pCANTAB5S、輔助噬菌體M13K07均由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室構(gòu)建保存[17]。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ購自華美生物公司；高效連接液購自TOYOBO公司；堿性磷酸酶 (CIP)、DNA marker購自寶生物工程 (上海) 公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN BIOTECH (北京)公司；質(zhì)粒抽提試劑盒及DNA Taq酶購自上海申能博彩生物公司。

1.1.3 引物序列

用于擴(kuò)增制備K51位、R55位隨機(jī)突變片段的引物共 6條，見表 1。用于噬菌粒展示載體pCANTAB5S中克隆片段的 PCR擴(kuò)增及測序引物為：pCANTAB5S-1：5′-CAACGTGAAAAAATTATT ATTCGC-3′ (上游引物)；pCANTAB5S-6：5′-GTAAA TGAATTTTCTGTATGAGC-3′ (下游引物)。以上引物均委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 K51位、R55位隨機(jī)突變片段的擴(kuò)增制備、酶切及純化

以pET32a-Tat質(zhì)粒為模板，以Up-1、51D為引物，擴(kuò)增51位和55位隨機(jī)突變的 Tat1-61(51N/55N)，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以pET32a-Tat質(zhì)粒為模板，以56U、Down-1為引物，擴(kuò)增 Tat56-101，PCR反應(yīng)條件同上。再以 Tat1-61 (51N/55N)、Tat56-101片段的PCR混合產(chǎn)物為模板，以Up-1、Down-1為引物，Overlap PCR擴(kuò)增51位和55位隨機(jī)突變的Tat1-101(51N/55N)，PCR反應(yīng)條件同上。最后以Tat1-101(51N/55N) 片段的PCR產(chǎn)物為模板，以 38U、61D為引物，擴(kuò)增51位和 55位隨機(jī)突變的Tat38-61(51N/55N)，PCR反應(yīng)條件同上。取Tat38-61(51N/55N) PCR產(chǎn)物，用XbaⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，膠回收純化。

1.2.2 噬菌粒pCANTAB5S的制備、酶切及去磷酸化處理

取pCANTAB5S TG1菌種接種于3 mL 2×YT (Amp) 培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒后用 XbaⅠ酶切，回收酶切后的pCANTAB5S載體，用2%瓊脂糖電泳定量。將回收后的酶切載體pCANTAB5S用CIP去磷酸化，回收經(jīng)過去磷酸化處理的pCANTAB5S載體，用2%瓊脂糖電泳定量。

1.2.3 Tat38-61(51N/55N) 突變體重組噬菌體展示原代文庫的構(gòu)建

取20 μL (4 μg) Tat38-61(51N/55N) 酶切片段與10 μL (2 μg) 經(jīng)去磷酸化處理的pCANTAB5S混勻，加入15 μL 高效連接液按說明書進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，加入500 μL 1.3×1012TU/mL的M13K07輔助噬菌體拯救，制備原代 Tat38-61(51N/55N) 突變體隨機(jī)組合噬菌體展示文庫。另取10 μL、1 μL、0.1 μL菌液涂LB (含Amp 100 ng/mL) 平皿計(jì)轉(zhuǎn)化數(shù)測定庫容。整個(gè)噬菌體展示文庫的構(gòu)建流程見圖1。

表1 Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)突變引物Table 1 Tat38-61(51N/55N) primers for random mutagenesis

1.2.4 噬菌體文庫滴度測定及無菌試驗(yàn)

取1 μL噬菌體文庫作10倍系列稀釋，各取10 μL噬菌體文庫感染對數(shù)生長期的E. coli TG1 100 μL，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后，涂布LB (含100 ng/mL Amp) 平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。計(jì)數(shù)不同稀釋度的平皿上生長的菌落數(shù)，菌落數(shù)乘以稀釋度再乘以 100即為每毫升噬菌體的轉(zhuǎn)化單位數(shù)(Transformation unit，TU)，即滴度。

無菌試驗(yàn)：取10 μL噬菌體濾液涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無菌落生長。

1.2.5 Tat38-61(51N/55N) 突變體庫的PCR鑒定及序列分析

分別從轉(zhuǎn)化平皿上挑 23個(gè)單克隆加入 SOB (Amp) 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)5 h后，以菌液為模板，pCANTAB5S-1、pCANTAB5S-6為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件同上。1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，通過電泳圖與陽性對照及DL2000 DNA marker比較判斷文庫中單克隆插入片段的大小和分布情況。

挑取PCR鑒定插入陽性單克隆33個(gè)，委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定，測序引物為pCANTAB5S克隆位點(diǎn)PCR鑒定引物pCANTAB5S-1和 pCANTAB5S-6，測序結(jié)果用DNASTAR軟件分析，根據(jù)測序結(jié)果分析 Tat38-61中51、55位氨基酸突變的隨機(jī)性。

圖1 Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建Fig. 1 Construction of Tat38-61(51N/55N) random mutation library.

2 結(jié)果

2.1 隨機(jī)突變體片段的擴(kuò)增、制備與酶切

以pET32a-Tat質(zhì)粒為模板，分別以Up-1、51D及56U、Down-1為引物，擴(kuò)增Tat1-61(51N/55N) 及Tat56-101，大小分別為183 bp和138 bp，與理論值相符；再以 Tat1-61(51N/55N)、Tat56-101片段的PCR混合產(chǎn)物為模板，以Up-1、Down-1為引物，Overlap PCR擴(kuò)增 Tat1-101(51N/55N)，大小為303 bp，與理論值相符；最后以Tat1-101(51N/55N)片段的PCR產(chǎn)物為模板，以38U、61D為引物，擴(kuò)增Tat38-61(51N/55N)，大小為138 bp，與理論值相符。Tat38-61(51N/55N) 片段回收后經(jīng)XbaⅠ酶切，得到酶切后大小為96 bp的Tat38-61(51N/55N) 片段 (圖2)。

2.2 噬菌粒pCANTAB5S的酶切及去磷酸化處理

噬菌粒pCANTAB5S經(jīng)XbaⅠ酶切，試劑盒回收純化，大小為4 555 bp，與理論值相符，與未酶切前的構(gòu)象區(qū)別明顯。經(jīng) CIP處理后的噬菌粒pCANTAB5S與酶切構(gòu)象保持一致 (圖3)。

圖2 Tat38-61(51N/55N) 突變體片段的PCR擴(kuò)增 (A) 及酶切鑒定 (B)Fig. 2 PCR amplification of fragment Tat38-61(51N/55N) (A) and restriction digestion analysis (B). (A) M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of Tat1-61(51N/55N); 2: PCR product of Tat56-101; 3: PCR product of Tat1-101(51N/55N) (303 bp); 4: PCR product of Tat 38-61(51N/55N). (B) M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of Tat38-61(51N/55N) digested with Xba I; 2: PCR product of Tat38-61(51N/55N) without digestion.

2.3 噬菌體展示 Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建

XbaⅠ酶切后的 Tat38-61(51N/55N) 片段與經(jīng)CIP處理的噬菌粒 pCANTAB5S連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TG1，輔助噬菌體M13K07拯救，得到Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)組合噬菌體展示文庫。該庫的庫容量即轉(zhuǎn)化數(shù)為5.0×106CFU，滴度為2.65× 1012TU/mL，無菌試驗(yàn)為0。

2.4 噬菌體展示 Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)組合文庫插入片段的檢測情況

PCR檢測組合文庫的插入片段情況見圖 4，可見不同插入片段在文庫中的分布比例如下：在23個(gè)單克隆中，插入0個(gè)Domain的即5S載體自連為10個(gè)，百分比為46.5%；1個(gè)Domain的為11個(gè)，占47.8%；2個(gè)Domain及以上的為2個(gè)，占8.7%；陽性克隆比例總計(jì)達(dá)56.5%。

2.5 隨機(jī)點(diǎn)突變組合文庫重組子測序結(jié)果

圖3 噬菌粒pCANTAB5S酶切和去磷酸化鑒定Fig. 3 Digestion and dephosphorylation identification of pCANTAB5S. M: DL2000 DNA marker; 1: phagemid pCANTAB5S; 2: pCANTAB5S digested with Xba I; 3: pCANTAB5S treated by CIP.

對33個(gè)Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)點(diǎn)突變組合文庫重組子質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，證實(shí)插入的序列為Tat38-61(51N/55N) 突變體基因，被突變的氨基酸位點(diǎn)分別是K51和R55，且核苷酸序列均不相同，突變頻率的比較結(jié)果見表 2。單點(diǎn)核苷酸的突變頻率范圍為理論值的 12%~157%(實(shí)際出現(xiàn)次數(shù)與理論出現(xiàn)次數(shù)之比)；各點(diǎn)平均后的核苷酸的突變頻率范圍為理論值的 64%~172%。所對應(yīng)的各氨基酸平均三點(diǎn)隨機(jī)突變頻率范圍為理論值的24%~283%，見表 3。51N-55N核苷酸序列與氨基酸序列均呈隨機(jī)排列組合，無偏向性，插入片段正反向均有 (24個(gè)正向，9個(gè)反向)，各種氨基酸及終止密碼子編碼在序列中分布均勻，表明本試驗(yàn)所構(gòu)建的噬菌體Tat38-61(51N/55N) 組合文庫以隨機(jī)方式組合。

圖4 PCR檢測文庫中不同大小插入片段克隆的分布Fig. 4 Distribution of colonies of inserted fragments with different size in combinatorial library detected by PCR. M: DL2000 DNA marker; 1?23: the number of 23 single colonies; 5S: the phagemid pCANTAB5S for positive control; C: the negative control.

表2 HIV-1 Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)突變組合文庫核苷酸突變頻率Table 2 Nucleotide mutation frequencies of the HIV-1 Tat38-61(51N/55N) combined site-directed random mutation library

表3 HIV-1 Tat38-61(51N/55N) 隨機(jī)突變組合文庫氨基酸突變頻率Table 3 Amino acid mutation frequencies of the HIV-1 Tat38-61(51N/55N) combined site-directed

3 討論

HIV感染所引起的艾滋病是全球重大公共衛(wèi)生問題之一，目前缺乏有效的疫苗用于預(yù)防。雖然HAART療法能有效治療艾滋病，但終身服藥及抗藥性的產(chǎn)生限制了 HAART療法的療效，因此，治療性疫苗作為艾滋病防治的新方法正愈來愈受到重視。HIV Tat作為一種病毒毒素，在艾滋病致病中發(fā)揮重要作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染者中 Tat抗體的水平與AIDS的發(fā)病呈明顯負(fù)相關(guān)，Tat抗體滴度高的感染者發(fā)病緩慢或長期不發(fā)病[18]。Tat蛋白可以誘導(dǎo)中和抗體，阻斷病毒復(fù)制和T細(xì)胞凋亡[19]，動(dòng)物試驗(yàn)表明，Tat疫苗引發(fā)了較強(qiáng)的抗體反應(yīng)和T細(xì)胞反應(yīng)，雖不能完全保護(hù)原發(fā)感染，但能明顯地降低病毒血癥，并具有長期的病毒感染抑制作用，顯示出Tat疫苗的應(yīng)用價(jià)值[20]。因此，以Tat為靶分子的治療性疫苗研發(fā)顯得尤為重要。

本研究擬用分子進(jìn)化技術(shù)這一新途徑尋找新型Tat免疫原。通過對天然Tat堿性區(qū)進(jìn)行重組改造，使之成為制備新免疫原的候選物，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建由該區(qū)段51和55位氨基酸隨機(jī)突變體相互隨機(jī)連接的重復(fù)串聯(lián)體的噬菌體展示文庫，用含有高中和活性的抗-Tat兔血清進(jìn)行進(jìn)化篩選，以期獲得免疫原性更強(qiáng)、穿膜活性更低的突變體。研究表明，用重組表達(dá)的具有活性的 Tat分子能產(chǎn)生很好的免疫效果。

HIV Tat分子內(nèi)包含很多抗原表位，其中主要為構(gòu)象表位，如果用抗-Tat抗體對噬菌體展示全長HIV Tat突變體庫進(jìn)行進(jìn)化篩選會(huì)因?yàn)榭乖贵w的相互作用過于復(fù)雜而得不到明確的結(jié)論，因此，我們選擇了HIV Tat分子內(nèi)重要的功能區(qū)段堿性區(qū)進(jìn)行展示。Tat分子具有天然非折疊蛋白的特征，屬于無規(guī)卷曲類型的分子，并且其構(gòu)象處于快速動(dòng)態(tài)的變化之中[21]，分子缺乏明確的高級結(jié)構(gòu)，其抗原性受高級結(jié)構(gòu)的影響很大，在 Tat堿性區(qū)內(nèi)含有明確的線性抗原表位，但側(cè)翼序列對其有很大的影響，因此，明確 Tat38-61的抗原性是分子進(jìn)化篩選必要的前提。為此，我們構(gòu)建了pET32a-Tat(38-61) 融合蛋白，采用本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立制備的兔抗 PEPTIDE-Tat(1-101)血清以及上海市公共衛(wèi)生中心提供的HIV陽性血清進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果表明Tat38-61與兔抗Tat血清及抗 HIV Tat陽性感染者血清特異反應(yīng)，證明Tat38-61較好地保留了其抗原性 (數(shù)據(jù)未顯示)。

由于Tat38-61編碼序列較短，通過PCR對其51和55位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)化難度較大，我們首先對全長Tat1-101的51和55位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)化，再以此為模板PCR擴(kuò)增Tat38-61編碼序列，結(jié)果順利地獲得了51和55位氨基酸隨機(jī)化的Tat38-61編碼序列并成功構(gòu)建了其噬菌體展示文庫，該庫容量為5.0×106，滴度為 2.65×1012TU/mL，片段插入率為56.5%。序列分析顯示該文庫中51、55位核苷酸的分布狀況與NNS隨機(jī)化的理論預(yù)測值相近 (表2)，所編碼氨基酸的情況與隨機(jī)化的理論預(yù)測值也相近(表3)。另外，正向插入與反向插入序列也均出現(xiàn)，符合隨機(jī)分布的規(guī)律。這些結(jié)果均表明所構(gòu)建的文庫顯示出良好的隨機(jī)性，達(dá)到了對該文庫進(jìn)行分子進(jìn)化篩選的要求，為后續(xù)的分子進(jìn)化篩選、新型Tat突變體的獲得及疫苗候選物的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，我們成功構(gòu)建了 HIV-1株Tat38-61(51N/55N) 堿性區(qū)突變體文庫，并且其庫容、多樣性、隨機(jī)性均達(dá)到文庫構(gòu)建要求，本實(shí)驗(yàn)室已將該文庫展示于絲狀噬菌體表面，且通過用不同抗體及血清對文庫進(jìn)行親和篩選，進(jìn)一步研究HIV-1 Tat38-61表位的分子進(jìn)化篩選，以期獲得理想的免疫原。

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