抗體庫的起源、發(fā)展及應(yīng)用前景

戴和平

中國科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室，武漢 430072

1 抗體庫的起源及抗體庫技術(shù)的發(fā)展

自從Susumu Tonegawa[1](利根川進，日本學(xué)者)闡明了產(chǎn)生抗體多樣性的分子機制，獲得了1987年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎后，人們逐漸意識到每個高等生物個體實際上就是一個抗體庫。一般哺乳動物的抗體基本單體結(jié)構(gòu)是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，每條重鏈或輕鏈又是由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。編碼抗體可變區(qū)的V基因和恒定區(qū)的C基因位于染色體DNA中的不同區(qū)域，在淋巴細(xì)胞的分化過程中，這些抗體基因片段能在染色體基因組內(nèi)進行重排，形成各種各樣的抗體重鏈或輕鏈基因，然后轉(zhuǎn)錄并翻譯成完整的抗體重鏈和輕鏈。據(jù)估計，在小鼠中，經(jīng)由基因重排、隨機組合和體細(xì)胞突變所產(chǎn)生的抗體多樣性可以達到 109~1011。這些多樣性的抗體組合存在于每一個個體中，這就是抗體庫最基本的來源[2]。

每一種B淋巴細(xì)胞只攜帶一種抗體基因，沒有經(jīng)歷特異抗原刺激的B淋巴細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。只有當(dāng)外源抗原與特異性B細(xì)胞受體相互結(jié)合，啟動一系列信號傳導(dǎo)和代謝變化后，才能導(dǎo)致特異性 B細(xì)胞增殖和分化，產(chǎn)生分泌型B細(xì)胞，分泌特異抗體，同時也產(chǎn)生記憶B細(xì)胞，持續(xù)保留，以備在二次免疫應(yīng)答時，快速產(chǎn)生特異性抗體。

傳統(tǒng)的多克隆抗體的制備技術(shù)，是將動物個體作為現(xiàn)成的抗體庫，通過純化的抗原，誘導(dǎo)特異性B淋巴細(xì)胞的增殖，產(chǎn)生大量的特異識別抗原的特異性抗體。由于一個抗原可能存在不止一個抗原決定簇 (4~6個氨基酸組成一個抗原決定簇)，因此該抗原所誘導(dǎo)的特異性B細(xì)胞可能是由不同種類的B細(xì)胞組成的細(xì)胞群，所產(chǎn)生的抗體可能不是一種，而是多種可以識別該抗原上不同抗原決定簇的多種抗體，所以這種抗體稱為多克隆抗體。

單克隆抗體的制備技術(shù)，是將特異抗原免疫后的小鼠B淋巴細(xì)胞從動物體內(nèi)取出來，再與人類腫瘤細(xì)胞融合，然后分離單細(xì)胞株，用ELISA方法鑒定分泌特異結(jié)合抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞，從而獲得單克隆抗體細(xì)胞株。單克隆抗體技術(shù)的優(yōu)勢是將抗體庫從動物體內(nèi)取出，在離體狀態(tài)下操作，是現(xiàn)代抗體庫技術(shù)的前奏。

基因工程抗體庫的構(gòu)建，是在1985年噬菌體展示技術(shù)[3]建立之后的 1990年開始的[4]。噬菌體展示技術(shù)的最大優(yōu)點是將外源蛋白的基因型和表達型有機地結(jié)合在一個噬菌體上，使得目的蛋白及其基因可以通過與固相化的配體相互作用而得到選擇，通過再次感染大腸桿菌而得以擴增。目前噬菌體展示技術(shù)已成功地應(yīng)用于各種抗體庫的構(gòu)建，該技術(shù)可以不經(jīng)過動物免疫，直接從動物的脾臟、外周血和骨髓中提取淋巴細(xì)胞的mRNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用專門設(shè)計的引物，利用PCR技術(shù)，將編碼抗體的可變部分的基因擴增出來，與編碼噬菌體外殼蛋白P3的基因偶聯(lián)，以融合蛋白質(zhì)的形式在噬菌體表面展示，如此而構(gòu)建高容量的噬菌體展示抗體文庫。其特異抗體的選擇模擬了自然免疫系統(tǒng)，用固相化的抗原從噬菌體展示抗體文庫中選擇特異性親和吸附的噬菌體抗體，然后將特異性吸附的噬菌體再感染大腸桿菌，得以擴增。這樣，經(jīng)過幾輪吸附-洗脫-擴增的親和選擇過程，特異性親和吸附的噬菌體抗體就會得到大大的富集，達到從抗體庫中分離出來的目的。噬菌體展示抗體庫技術(shù)明顯優(yōu)于單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，使特異性單克隆抗體的獲取更方便、更省時省力；可被高通量自動化操作，也可被工廠化生產(chǎn)，被認(rèn)為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ?、可與蛋白質(zhì)組學(xué)配套、為抗體芯片制備提供充足抗體資源的技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)現(xiàn)在已擴展到細(xì)胞表面展示技術(shù)，如細(xì)菌、酵母、人細(xì)胞等的表面展示。還有最小單位的展示系統(tǒng)，如mRNA展示、DNA展示系統(tǒng)等，都是將一個蛋白的基因型和表達型直接地連為一體。由于這類展示系統(tǒng)靠體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進行蛋白表達，靠PCR技術(shù)對目的抗體基因進行擴增，不需要宿主細(xì)胞，所以克服了宿主細(xì)胞的局限性，可以使抗體庫的多樣性達到 1012~1014。這些不同的展示系統(tǒng)可以統(tǒng)稱為分子展示，在 Gr?wall和St?hl綜述[5]中有較詳細(xì)的描述，本文不再贅述。表1是對目前主要用于抗體庫構(gòu)建的各種分子展示系統(tǒng)的簡單歸納，并沒有完全包括所有的展示系統(tǒng)。

表1 各種分子展示系統(tǒng)Table 1 Various molecular display system

還有一種類似于酵母雙雜交模式的抗體庫技術(shù)，稱為胞內(nèi)抗體庫，其抗體的表達和篩選在細(xì)胞內(nèi)進行。首先通過基因操作，將目的抗原與一種蛋白的DNA結(jié)合域融合，將其cDNA轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，以此作為釣餌；另一方面，將這種蛋白的激活域與抗體庫的單鏈抗體融合，將其cDNA也轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。當(dāng)抗體庫中某個抗體可以與目標(biāo)抗原相結(jié)合時，就會導(dǎo)致該細(xì)胞成活，進而導(dǎo)致該特異性識別抗體得到表達和純化。因為胞內(nèi)抗體 (Intrabody) 的篩選是在細(xì)胞內(nèi)進行的，所以保證了所獲得的抗體都具有生物功能[18]。

2 抗體庫的種類

在臨床大量使用的多克隆抗體和單克隆抗體多為免疫球蛋白IgG1形式，其完整天然抗體是由2條重鏈和2條輕鏈所組成，分子量約為150 kDa。由于分子量較大，在一些方面的應(yīng)用受到了限制，如較低的組織穿透性 (腫瘤)，或者無法與某些小裂隙中的分子表面結(jié)合 (HIV包膜糖蛋白) 等?？贵w的可變部分是特異識別抗原的結(jié)構(gòu)域，只占完整抗體的一小部分，抗體工程就是利用基因工程技術(shù)，將編碼抗體的這一小部分基因克隆，其優(yōu)勢之一是可以制造小分子量的抗體，以解決天然抗體無法解決的問題。目前分子展示抗體庫的類型主要是由鼠源、人源或駱駝等其他動物來源的抗體片段組成，如單鏈抗體 (Single chain fragment of variable，ScFv)，是由一個柔軟的小肽連接重鏈和輕鏈的可變區(qū)，組成一個單鏈多肽，分子量約在28 kDa左右；再就是Fab抗體，主要由重鏈和輕鏈的可變區(qū)和部分恒定區(qū)組成，分子量約54 kDa左右；還有單獨重鏈或單獨輕鏈的可變區(qū)，分子量約15 kDa等等。這些抗體片段具有與天然抗體一樣的抗原識別特異性，一樣的親合力 (Affinity)，但是由于它們都是單價位與抗原結(jié)合，因此它們與抗原的親合結(jié)合力 (Avidity) 比天然抗體弱。通過基因工程技術(shù)，實現(xiàn)了兩價至多價的小抗體片段組合體；或?qū)⒖贵w的恒定區(qū)Fc片段與小分子抗體可變區(qū)片段連接，使鼠源的抗體人源化，恢復(fù)其協(xié)同體內(nèi)其他免疫分子和細(xì)胞清除外源抗原的能力，并提高其穩(wěn)定性，這方面的研究綜述可參考文獻[19]和[20]。

有的抗體庫來源于經(jīng)特異抗原免疫過的動物，這樣的抗體庫中具有大量已經(jīng)誘導(dǎo)的特異性抗體，可有效地針對目的抗原選擇高親和力的特異性抗體。但是其局限性也是顯而易見的，這樣的抗體庫的應(yīng)用范圍比較窄，必須針對不同的抗原構(gòu)建不同的抗體庫。為了擴大抗體庫的使用范圍，有的抗體庫來源于非免疫過的動物。一般而言，構(gòu)建天然抗體庫需要從未經(jīng)特異性免疫過動物的骨髓干細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞和脾臟B細(xì)胞中獲取抗體可變區(qū)的mRNA[21]。因為在骨髓中分化成熟的B淋巴細(xì)胞在進入外周血前，已經(jīng)通過某種機制，將能識別自身抗原的B淋巴細(xì)胞殺死，從而避免自身免疫疾病的發(fā)生[2]。為了提供抗體的多樣性，避免某些抗體的過量存在，必須選用未免疫過的動物，并將其骨髓中的B淋巴細(xì)胞也要提取出來，才能保證抗體的多樣性。天然抗體庫的庫容量需要達到109~1010以上，才能保證抗體的多樣性在理論意義上滿足各種抗原特異性抗體的淘選，因此天然抗體庫構(gòu)建的工作量很大，但是應(yīng)用范圍較廣泛。大容量天然抗體庫特別適用于一些用傳統(tǒng)多克隆和單克隆抗體技術(shù)無法獲取的抗體，比如識別高度物種保守的蛋白序列的抗體，或識別有毒抗原的抗體，或僅識別不同連接鍵、而氨基酸序列完全相同的抗原結(jié)合位點，等等。大容量天然抗體庫結(jié)合高通量技術(shù)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域具有強大的應(yīng)用前景[22]?？贵w-抗原結(jié)合的特異性取決于結(jié)合區(qū)域的空間構(gòu)象，主要與抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)中的 3個互補決定區(qū)(Complementarity determining region，CDR) 環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸序列有關(guān)。將CDR區(qū)的編碼基因序列進行計算機設(shè)計，對其進行隨機突變，但是保留CDR區(qū)外的框架結(jié)構(gòu)不變，可以大大提高抗體庫的多樣性，這種通過人工操作增加抗體多樣性所構(gòu)建的抗體庫稱為人工合成抗體庫[20,23]。

目前，出現(xiàn)了各種各樣非免疫球蛋白的抗體替代物。這些抗體替代物在一級結(jié)構(gòu)上與抗體分子完全不同，但在框架結(jié)構(gòu)上與抗體可變區(qū)有相似結(jié)構(gòu)特點。通過計算機設(shè)計，在保證框架結(jié)構(gòu)不變的基礎(chǔ)上，對某一特定的蛋白分子表面區(qū)域的氨基酸組成進行隨機化組合，從而構(gòu)建類似于抗體庫的框架蛋白 (Scaffold proteins) 文庫[24]，并將其展示在噬菌體表面，用于篩選特異性識別各種抗原的蛋白結(jié)合體。這些框架蛋白來源廣泛，有的來自原核細(xì)菌，有的來自人類，雖然它們的一級結(jié)構(gòu)完全不同，但它們通常都具有以下特點：1) 蛋白穩(wěn)定性高，能耐受高溫和高濃度變性劑的影響，室溫中長期保存不變性；2) 蛋白分子小，具有很好的滲透性和遷移性；3) 蛋白可溶性高，能夠在大腸桿菌中以高產(chǎn)量表達，造價低廉?？蚣艿鞍孜膸斓难芯吭跉W美發(fā)展迅速，特別是在歐洲，幾十種框架蛋白文庫已被成功構(gòu)建。一些特異識別癌細(xì)胞的框架蛋白從框架蛋白文庫中得到了成功地分離，并通過了臨床實驗，應(yīng)用于癌癥的診斷和藥物導(dǎo)航，有的已經(jīng)實現(xiàn)了商品化。但在中國，新型框架蛋白文庫的構(gòu)建幾乎為零。表2列舉了一些框架蛋白。綜述文獻[24-26]對框架蛋白有較為詳細(xì)的敘述。

表2 框架蛋白舉例Table 2 Examples of protein scaffolds

另外一種抗體替代物是 RNA/DNA適配子(Aptamer)[41]。這是一種人工合成的RNA或DNA隨機序列片段，這些隨機序列可以形成無數(shù)種構(gòu)象，RNA/DNA適配子文庫的多樣性可以達到 1015。RNA/DNA適配子庫可以展示在微珠上，對小分子化合物和大分子蛋白質(zhì)等其他分子可以通過反復(fù)的吸附、洗脫、PCR擴增過程，從文庫中篩選到特異識別的適配子。與蛋白類抗體庫技術(shù)相比，適配子庫有更多的優(yōu)點。首先，適配子與抗體一樣具有特異性識別分子的能力和高親合力，但它的選擇和分離完全不需要生物宿主；適配子的選擇和生產(chǎn)完全是在體外操作和化學(xué)合成，不受生物條件限制，因此結(jié)果的重復(fù)性更好；最后，適配子比抗體耐高溫，因此穩(wěn)定性更好。有關(guān)適配子的應(yīng)用在文獻綜述[41-42]中有詳細(xì)的敘述，可以參考。

3 抗體庫的應(yīng)用現(xiàn)狀和問題

抗體庫技術(shù)模擬并簡化了天然抗體庫的特異性抗體的產(chǎn)生過程，使得抗體選擇可以根據(jù)人類的需要，在體外操作，通過特異性抗體選擇策略的不斷優(yōu)化和抗體工程設(shè)計，賦予了抗體在天然狀態(tài)下不可能具備的新功能。分子展示抗體庫或抗體替代物文庫主要應(yīng)用于如下一些方面：1) 作為分子診斷工具，應(yīng)用于微生物病原體、癌癥生物標(biāo)志物的檢測，生命科學(xué)研究中的分子識別。2) 組成微陣列芯片，更新了免疫診斷的模式，使診斷水平上升到蛋白質(zhì)組學(xué)的高度；3) 作為特異性親合吸附的分子工具，將其與細(xì)胞毒性藥物或標(biāo)識物偶聯(lián)，應(yīng)用于藥物導(dǎo)航和體內(nèi)示蹤診斷；4) 作為空間構(gòu)象的識別體，應(yīng)用于穩(wěn)定或區(qū)別不同構(gòu)象的目的蛋白；5) 作為具有中和病原體和毒素效應(yīng)的抗體，應(yīng)用于治療病毒感染和解毒；6) 將小分子的抗體引入細(xì)胞內(nèi)(Intrabody)，發(fā)揮分子調(diào)節(jié)的功能，應(yīng)用于HIV、癌癥、神經(jīng)退化性疾病和器官移植等治療中；7) 作為親合吸附材料，偶聯(lián)在層析柱上，用于分離和純化目的蛋白；等等。這些應(yīng)用領(lǐng)域都在相關(guān)綜述[43-47]中得到了詳細(xì)地敘述，供讀者參考。

從上述對抗體庫應(yīng)用的簡述中可以看到，抗體庫技術(shù)結(jié)合抗體工程，有多種靈活機動的應(yīng)用技巧和廣泛的應(yīng)用范圍，但到目前為止，抗體庫技術(shù)的應(yīng)用潛力還遠遠沒有發(fā)揮出來。比如，抗體庫最大的特點就是它的多樣性和它的高通量，而目前大多數(shù)的應(yīng)用是將單個抗原從高容量的抗體庫中淘選特異性結(jié)合抗體。實際上，自然情況下的動物個體的免疫系統(tǒng)是同時對環(huán)境出現(xiàn)的多種抗原作出平行反應(yīng)的，生物體有自己一套高效率的機制，可以同時從抗體庫中選擇、擴增相應(yīng)B細(xì)胞，制備出各種識別外源物的抗體。而當(dāng)用人工方法模擬這種高通量選擇方法時，困難還是很大的。因為目前的分子展示抗體庫的分離和選擇過程涉及到抗原的固相化、抗體-抗原結(jié)合、洗脫、擴增、鑒定等步驟，涉及到大量的克隆子，需要進行平行操作。如何將多抗原同時、平行地從抗體庫中選擇各自的特異性抗體，是目前所面臨的挑戰(zhàn)。已有一些實驗室在這方面作出了開創(chuàng)性的工作[48-49]。一般采取兩種策略，一是將各種抗原固相化在96孔板、NC膜，或芯片上，借助自動化平行操作平臺，對抗體庫進行淘選；另一種策略是，將各種抗原分別固相化在小磁珠上，借助流式細(xì)胞儀對抗體庫進行淘選。這方面的研究進展可參考文獻[25,50-52]。

4 抗體庫的應(yīng)用前景和展望

隨著后基因組時代的發(fā)展，人們對生命現(xiàn)象的了解已經(jīng)不能滿足于對一個生物分子的單獨研究，而是希望對生物整體的分子變化和響應(yīng)進行研究，因此將抗體庫與蛋白質(zhì)組建立一一對應(yīng)的鏡像關(guān)系，發(fā)揮其高通量分子識別的作用越來越重要，由此提出了親和力蛋白質(zhì)組學(xué)的概念[53]。所謂親和力蛋白質(zhì)組學(xué)，是以親和力為基礎(chǔ)的抗體或抗體替代物，作為工具應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)以及診斷學(xué)，主要包括蛋白質(zhì)組學(xué)層面的蛋白質(zhì)的高效純化方法，蛋白質(zhì)表達譜的高通量檢測以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的探測方法等。

但是目前抗體庫對高通量抗原的篩選技術(shù)的發(fā)展困難很大。到目前為止，還只能是用幾個抗原對抗體庫進行平行篩選[54-55]，遠遠沒有解決將成百上千個抗原同時對抗體庫平行篩選的問題。這是因為依賴于生物宿主的抗體庫分子展示系統(tǒng)存在諸多影響因素，比如宿主細(xì)胞個體存在生長速度的差異性，蛋白質(zhì)相互作用的非特異性結(jié)合，選擇壓力的偏向性等都會使得篩選過程的陽性克隆鑒定面臨海量的單克隆個體，超出了目前高通量自動化操作平臺的能力。一般而言，一個抗原對抗體庫的篩選將導(dǎo)致200~1 000個單克隆子的平行鑒定。作者認(rèn)為，解決抗體庫高通量篩選的技術(shù)瓶頸的首要問題是解決生物宿主的問題。生物宿主具有生命，受很多因素的限制，因此最好的辦法就是繞開它。目前，無細(xì)胞分子展示抗體庫和DNA/RNA適配子庫因為不依賴于細(xì)胞生長，應(yīng)該是重點選擇的對象，而DNA/RNA適配子庫完全是化學(xué)合成的，結(jié)合目前已經(jīng)比較成熟的DNA高通量測序技術(shù)，有可能是解決上述瓶頸問題的突破口[56]。

在我國，目前還沒有一個具有自主創(chuàng)新的抗體庫構(gòu)建成功的報道，對分子展示抗體庫的應(yīng)用與先進國家相比差距也較大。作者個人認(rèn)為，一種新型抗體庫的構(gòu)建是要基于非常深厚的研究積累和條件的，而目前各種抗體庫的種類已經(jīng)夠多的了，我們國家沒有必要再花金錢和人力去新添一種抗體庫，而是應(yīng)該將精力放在應(yīng)用技術(shù)的創(chuàng)新上。比如，抗體庫篩選的高通量、自動化操作平臺的改進或創(chuàng)新，還有很大的發(fā)展空間[57]，通過我國生物科學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)科技人員的合作和努力，應(yīng)該可以取得創(chuàng)新性成果；另外，抗體庫目前應(yīng)用較多的是醫(yī)療領(lǐng)域，特別突出的是癌癥的生物標(biāo)志物的檢測和體內(nèi)示蹤，而在環(huán)境污染的健康風(fēng)險評價方面卻應(yīng)用得很少，而這個研究領(lǐng)域也是需要對環(huán)境污染暴露的生物和人體的整體分子響應(yīng)進行高通量分析，抗體庫應(yīng)該在這個領(lǐng)域大有作為。總之，抗體庫的優(yōu)勢和潛力要靠應(yīng)用而發(fā)揮，抗體庫的技術(shù)問題也要靠應(yīng)用而得到解決。

[1] Newmark P. Nobel prize for Japanese immunologist. Nature, 1987, 329(6140): 570.

[2] Liu JX, Zheng CX. Current Immunology—Elements of Immune Cells and Molecules. Beijing: Tsinghua University Press, 2002.劉建欣, 鄭昌學(xué). 現(xiàn)代免疫學(xué)——免疫的細(xì)胞和分子基礎(chǔ). 北京: 清華大學(xué)出版社, 2002.

[3] Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vector that display cloned antigens on the viron surface. Science, 1985, 228(4705): 1315?1317.

[4] McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature, 1990, 348(6301): 552?554.

[5] Gr?wall C, St?hl S. Engineered affinity proteinsgeneration and applications. J Biotechnol, 2009, 140(3/4): 254?269.

[6] Barbas CF III, Burton DR, Scott JK, et al. Phage Display: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[7] Daugherty PS. Protein engineering with bacterial display. Curr Opin Struct Biol, 2007, 17(4): 474?480.

[8] L?fblom J, Sandberg J, Wernérus H, et al. Evaluation of staphylococcal cell surface display and flow cytometry for postselectional characterization of affinity proteins in combinatorial protein engineering applications. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(21): 6714?6721.

[9] Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol, 1997, 15(6): 553?557.

[10] Ho M, Nagata S, Pastan I. Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(25): 9637?9642.

[11] Hanes J, Plückthun A. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(10): 4937?4942.

[12] Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, et al. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3’-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett, 1997, 414(2): 405?408.

[13] Roberts RW, Szostak JW. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(23): 12297?12302.

[14] Tabuchi I, Soramoto S, Nemoto N, et al. An in vitro DNA virus for in vitro protein evolution. FEBS Lett, 2001, 508(3): 309?312.

[15] Bertschinger J, Grabulovski D, Neri D. Selection of single domain binding proteins by covalent DNA display. Protein Eng Des Sel, 2007, 20(2): 57?68.

[16] Sepp A, Tawfik DS, Griffiths AD. Microbead display by in vitro compartmentalisation: selection for binding using flow cytometry. FEBS Lett, 2002, 532(3): 455?458.

[17] Nord O, Uhlén M, Nygren P. Microbead display of proteins by cell-free expression of anchored DNA. J Biotechnol, 2003, 106(1): 1?13.

[18] Visintina M, Melib GA, Cannistracia I, et al. Intracellular antibodies for proteomics. J Immunol Methods, 2004, 290(1/2): 135?153.

[19] Bradbury A, Velappan N, Verzillo V, et al. Antibodies in proteomics I: generating antibodies. Trends Biotechnol, 2003, 21(6): 275?281.

[20] Holliger P, Hudson PJ. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol, 2005, 23(9): 1126?1136.

[21] Sommavilla R, Lovato V, Villa A, et al. Design and construction of a na?ve mouse antibody phage display library. J Immunol Methods, 2010, 353(1/2): 31?43

[22] Pansri P, Jaruseranee N, Rangnoi K, et al. A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens. BMC Biotechnol, 2009, 9: 6.

[23] Filpula D. Antibody engineering and modification technologies. Biomol Eng, 2007, 24(2): 201?215.

[24] Hey T, Fiedler E, Rudolph R, et al. Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical and industrial applications. Trends Biotechnol, 2005, 23(10): 514?522.

[25] Tomizaki K, Usui K, Mihara H. Protein-protein interactions and selection: array-based techniques for screening disease-associated biomarkers in predictive/early diagnosis. FEBS J, 2010, 277(9): 1996?2005.

[26] Hosse RJ, Rothe A, Power BE. A new generation of protein display scaffolds for molecular recognition. Protein Sci, 2006, 15(1): 14?27.

[27] Koide A, Bailey CW, Huang XL, et al. The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins. J Mol Biol, 1998, 284(4): 1141?1151.

[28] Xu LH, Aha P, Gu K, et al. Directed evolution of high-affinity antibody mimics using mRNA display. Chem Biol, 2002, 9(8): 933?942.

[29] Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, et al. Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain. Nat Biotechnol, 1997, 15(8): 772?777.

[30] Beste G, Schmidt FS, Stibora T, et al. Small antibody-like proteins with prescribed ligand specificities derived from the lipocalin fold. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(5): 1898?1903.

[31] Borghouts C, Kunz C, Groner B. Peptide aptamers: recent developments for cancer therapy. Expert Opin Biol Ther, 2005, 5(6): 783?797.

[32] Silverman J, Liu Q, Bakker A, et al. Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains. Nat Biotechnol, 2005, 23: 1556?1561.

[33] Binz HK, Amstutz P, Plückthun A. Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat Biotechnol, 2005, 23(10): 1257?1268.

[34] Dennis MS, Lazarus RA. Kunitz domain inhibitors of tissue factor-factor Vlla. I. Potent inhibitors selected from libraries by phage display. J Biol Chem, 1994, 269(35): 22129?22136.

[35] Williams A, Baird LG. DX-88 and HAE: a developmental perspective. Transfus Apher Sci, 2003, 29(3): 255?258.

[36] Schneider S, Buchert M, Georgiev O, et al. Mutagenesis and selection of PDZ domains that bind new protein targets. Nat Biotechnol, 1999, 17(2): 170?175.

[37] Ferrer M, Maiolo J, Kratz P, et al. Directed evolution of PDZ variants to generate high-affinity detection reagents. Protein Eng Des Sel, 2005, 18(4): 165?173.

[38] Smith GP, Patel SU, Windass JD, et al. Small binding proteins selected from a combinatorial repertoire of knottins displayed on phage. Mol Biol, 1998, 277(2): 317?332.

[39] Lehti? J, Teeri TT, Nygren P?. Alpha-amylase inhibitors selected from a combinatorial library of a cellulose binding domain scaffold. Proteins, 2000, 41(3): 316?322. [40] Hey T, Fiedler E, Rudolph R, et al. Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical and industrial applications. Trends Biotechnol, 2005, 23(10): 514?522.

[41] Collett JR, Cho EJ, Ellington AD. Production and processing of aptamer microarrays. Methods, 2005, 37(1): 4?15.

[42] Torres-Chavolla E, Alocilja EC. Aptasensors for detection of microbial and viral pathogens. Biosens Bioelectron, 2009, 24(11): 3175?3182.

[43] Brennan DJ, O'Connor DP, Rexhepaj E, et al. Antibody-based proteomics: fast-tracking molecular diagnostics in oncology. Nat Rev Cancer, 2010, 10(9): 605?617.

[44] Cheng AKH, Sen D, Yu HZ. Design and testing of aptamer-based electrochemical biosensors for proteins and small molecules. Bioelectrochemistry, 2009, 77(1): 1?12. [45] Bratkovi? T. Progress in phage display: evolution of the technique and its applications. Cell Mol Life Sci, 2010, 67(5): 749?767.

[46] Manjappa AS, Chaudhari KR, Venkataraju MP, et al. Antibody derivatization and conjugation strategies: application in preparation of stealth immunoliposome to target chemotherapeutics to tumor. J Control Release, 2011, 150(1): 2?22.

[47] Friedman M, St?hl S. Engineered affinity proteins for tumour-targeting applications. Biotechnol Appl Biochem, 2009, 53(1): 1?29.

[48] Lo ASY, Zhu Q, Marasco WA. Intracellular antibodies (intrabodies) and their therapeutic potential. Handb Exp Pharmacol, 2008, 181: 343?373.

[49] Bradbury A, Velappan N, Verzillo V, et al. Antibodies in proteomics II: screening, high-throughput characterization and downstream applications. Trends Biotechnol, 2003, 21(7): 312?317.

[50] Yang L, Nolan JP. High-throughput screening and characterization of clones selected from phage display libraries. Cytometry A, 2007, 71(8): 625?631.

[51] Turunen L, Takkinen K, S?derlund H, et al. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol Screen, 2009, 14(3): 282?293.

[52] Sepp A, Tawfik DS, Griffiths AD. Microbead display by in vitro compartmentalisation: selection for binding using flow cytometry. FEBS Lett, 2002, 532(3): 455?458.

[53] Uhlén M. Affinity as a tool in life science. Biotechniques, 2008, 44(5): 649?654.

[54] Walter G, Büssow K, Lueking A, et al. High-throughput protein arrays: prospects for molecular diagnostics. Trends Mol Med, 2002, 8(6): 250?253.

[55] Liu Y, Adams JD, Turner K, et al. Controlling the selection stringency of phage display using a microfluidic device. Lab Chip, 2009, 9(8): 1033?1036.

[56] Brody EN, Gold L, Lawn RM, et al. High-content affinitybased proteomics: unlocking protein biomarker discovery. Expert Rev Mol Diagn, 2010, 10(8): 1013?1022.

[57] Mayr LM, Fuerst P. The future of high-throughput screening. J Biomol Screen, 2008, 13(6): 443?448.