鹽酸地芬尼多在保存血液中的分解動力學研究1）

萬東方，武 奪，武珊珊，贠克明

鹽酸地芬尼多片作為非處方類抗暈動藥之一，應用比較廣泛，偶有中毒和死亡發(fā)生［1－3］。有關(guān)鹽酸地芬尼多中毒的研究主要為毒物檢測方法以及中毒和自殺的個案等方面的報道［4－6］，與中毒法醫(yī)學鑒定有關(guān)的毒物動力學研究報道較少［7］。保存血液中的分解動力學未見報道。本實驗采用鹽酸地芬尼多染毒犬中毒模型，研究鹽酸地芬尼多在保存血液中的分解動力學，為鹽酸地芬尼多中毒法醫(yī)學鑒定時檢材保存和血藥濃度的推斷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與分析條件

1.1.1 氣相色譜儀（Finnigan） aw34色譜條件：NPD檢測器，DB－5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫：150℃（1 min）→10℃/min→280℃（2 min）；檢測器：NPD，300℃，空氣60 k Pa，氫氣2.3 k Pa；載氣：N21.5 m L/min。

1.1.2 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（Finnigan DSQ） 色譜條件：DB－5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），EI源70ev，質(zhì)量范圍：50～650，柱溫：150℃（1 min）→10℃/min→280℃（2 min）；離子源溫度：200℃，傳輸線溫：250℃，載氣：He 1.5 mL/min。

1.2 試劑 鹽酸地芬尼多片（大連天宇海濱制藥有限公司，批號：050703）；鹽酸地芬尼多標準品購于公安部物證鑒定中心；其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 本地雜種犬4只，15 kg～20 kg，雄性，山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.4 提取與檢測 血液1 m L，加水2 m L，勻漿5 min；取全部勻漿液，加入內(nèi)標物SKF20μg，1 m L飽和NaCO3調(diào)p H＝9～

11，5 m L乙醚萃取，振蕩15 min，離心3000 r/min×15 r/min，取上清液4 mL置于干燥離心管中。乙醚重新萃取一次。合并兩次乙醚萃取液，40℃恒溫水浴揮去乙醚。殘渣加150μL乙醇定容，取1μL進樣。保留時間結(jié)合特征離子峰（氣－質(zhì)聯(lián)用）定性，內(nèi)標法和標準曲線法（氣相色譜）定量。

1.5 血液樣品中的分解動力學 禁食隔夜犬4只，5 min內(nèi)胃管勻速注入鹽酸地芬尼多148 mg/kg，注入藥物2 h后處死實驗動物，采集心血，肝素抗凝。每只犬血分四等份分別置于20℃、4℃、NaF、－20℃環(huán)境中，于0、1 d、4 d、10 d、30 d、60 d檢測血液中鹽酸地芬尼多含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 氣相色譜和氣相色譜質(zhì)譜圖（見圖1～4）

2.2 工作曲線 準確吸取不同量度鹽酸地芬尼多標準品，分別加至1 mL空白血中，配制成系列標準血樣，測0.5μg/m L～32 μg/mL范圍，鹽酸地芬尼多與內(nèi)標峰面積比對濃度，成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r＝0.999，線性方程為Y＝0.053X＋0.049。

2.3 回收率和精密度 取空白檢材1 m L，分別加入鹽酸地芬尼多標準溶液，檢測，測得回收率高于90%（結(jié)果見表1），變異系數(shù)CV＜3%。

表1 鹽酸地芬尼多血液回收率實驗結(jié)果（ ±s）

表1 鹽酸地芬尼多血液回收率實驗結(jié)果（ ±s）

加標濃度（μg/m L） 檢出濃度（μg/m L） 回收率（%）5 4.98±0.12 99.6±2.410 10.23±0.26 102.3±2.620 18.32±0.30 91.6±1.5

2.4 分解動力學研究

2.4.1 保存血液中不同時間點鹽酸地芬尼多的含量變化（見表2）

表2 不同時間點保存血液中鹽酸地芬尼多含量變化（ ±s） μg/m L

表2 不同時間點保存血液中鹽酸地芬尼多含量變化（ ±s） μg/m L

時段 20℃ 20℃（1%N a F）4℃ －20℃0 16.65±7.38 16.65±7.38 16.65±7.38 16.65±7.381 d 15.36±5.98 15.12±10.34 16.48±8.91 15.60±9.0010 d 15.68±7.20 15.91±9.33 16.31±8.20 13.92±7.3130 d 14.10±8.45 11.13±5.13 1） 13.52±5.54 13.53±5.7560 d 12.32±6.39 1） 10.26±5.74 1） 10.88±4.76 1） 11.40±4.51 1）120 d 12.87±1.4 1） 8.87±6.03 1） 9.12±3.96 1） 10.25±6.81 1）180 d 12.00±6.24 1） 7.58±5.31 1） 9.00±2.59 1） 10.65±8.60 1）240 d 11.34±5.12 1） 6.30±7.24 1） 8.88±4.56 1） 11.05±6.02 1）300 d 9.72±2.98 1） 5.25±4.28 1） 8.04±5.40 1） 11.01±5.92 1）與0時含量相比，1）P＜0.05

2.4.2 分解動力學參數(shù) 采用Win Nor Lin藥代動力學軟件處理平均藥物濃度－時間數(shù)據(jù)，其分解符合一級動力學過程。

表4 不同保存條件下血液中鹽酸地芬尼多分解動力學參數(shù)

3 討 論

3.1 GC、GC/MS檢測 目前國內(nèi)外有關(guān)鹽酸地芬尼多的檢測方法有毛細管電泳法［4］、HLPC［5，6］法和 GC/MS法［7］。GC 和HPLC法定量較好，定性差，GC/MS定性定量均較好。本實驗綜合比較了這些方法后首先建立了血液中鹽酸地芬尼多的GC和GC/MS分析方法。該方法在選定條件下鹽酸地芬尼多和內(nèi)標SKF525與其他雜質(zhì)峰形分離良好，且靈敏度高，重現(xiàn)性好，同時檢材用量少、操作簡便、快速，適合于生物檢材中鹽酸地芬尼多的檢測和臨床藥物監(jiān)測。

3.2 分解動力學 毒物分解動力學研究毒物在尸體、檢材和自然環(huán)境中動態(tài)變化過程或穩(wěn)定性，運用動力學理論和分析技術(shù)經(jīng)數(shù)學模擬來揭示此變化過程的規(guī)律性［8］。保存檢材中毒物的分解動力學主要受保存條件的影響，包括溫度、時間、器皿類型、防腐劑、p H值及其他等。防腐劑對生物檢材中的毒物是否會產(chǎn)生影響與防腐劑的種類以及毒物的種類等有關(guān)［9－15］。

本實驗結(jié)果顯示，20℃、4℃、－20℃和20℃（1%NaF）保存60 d、120 d、180 d和240 d時，血液中鹽酸地芬尼多含量顯著下降為初始濃度的74.00%、65.32%、68.45%和66.85%，保存300 d時顯著下降為為初始濃度的58.39%、48.27%、66.12%和31.51%，分解半衰期分別為462.32 d、238.21 d、490.56 d和168.84 d。鹽酸地芬尼多在保存血液樣品中可分解。各保存條件下同一時間點鹽酸地芬尼多含量無統(tǒng)計學意義。說明保存溫度和抑菌劑對其影響不大。鹽酸地芬尼多中毒案件法醫(yī)學鑒定中所采血樣應在30 d內(nèi)送檢和檢驗。

血中平均藥物濃度－時間數(shù)據(jù)擬合結(jié)果顯示，保存全血中鹽酸地芬尼多的分解動力學符合一級動力學過程。應用血中鹽酸地芬尼多分解動力學數(shù)學模型和參數(shù)，可以推測血中藥物濃度的經(jīng)時變化，推斷中毒死亡當時或檢材采取當時尸體或檢材中藥物含量，指導選擇最佳檢材存放條件，正確分析和使用毒物分析結(jié)果。

本實驗證明，鹽酸地芬尼多在保存血液樣品中可分解，保存溫度和抑菌劑對其影響不大。因此，鹽酸地芬尼多中毒案件法醫(yī)學鑒定中所采血樣應在30 d內(nèi)送檢和檢驗，否則可用其分解動力學方程和參數(shù)推斷中毒死亡當時或檢材采集當時的血藥濃度。

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