新城疫病毒感染過程中基質(zhì)蛋白的動態(tài)分布

孫英杰,陳鴻軍,詹 媛,于 洋,仇旭升,宋翠萍,于圣青,丁 鏟

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海閔行 200241）

新城疫(ND）是由新城疫病毒(NDV）引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病,一直是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的最主要病患之一。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析可將不同基因組長度的NDV病毒分為兩個群,即ClassⅠ(15 198 nt）和 ClassⅡ(15 192 nt或15 186 nt）[1]。于圣青等研究發(fā)現(xiàn)一株從野生水禽分離到的非致病性NDV毒株,在SPF雞體內(nèi)經(jīng)過9次氣囊接種(9a）和5次腦內(nèi)接種(5b）傳代后,演變?yōu)樗侔l(fā)型NDV,從而證實NDV弱毒株可以在雞體內(nèi)經(jīng)傳代后發(fā)生毒力變異[2]。

Class INDV基因組為單鏈、不分節(jié)段的負鏈RNA,編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白,即核衣殼蛋白(NP）、磷蛋白(P）、基質(zhì)蛋白(M）、融合蛋白(F）、血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN）和大分子蛋白(L）[2]。其中,基質(zhì)蛋白(m atrix p rotein）基因全長 1 241 bp,編碼364個氨基酸,位于病毒囊膜內(nèi)層,構(gòu)成病毒囊膜的支架,高度保守,在RNA的合成和病毒的自身裝配上起重要的作用[3]。本試驗擬通過原核表達M蛋白,研制特異性抗體,分析M蛋白在Class INDV病毒感染細胞過程中,M蛋白的亞細胞動態(tài)定位情況,旨在為深入開展M蛋白與病毒增殖、宿主相互作用機制的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒 15代NDV分離株由本室保存。由于圣青將一株NDV無毒株(Goose/A laska/415/91）在雞氣囊中傳代9次(9a）,再在腦內(nèi)傳代5次(5b）,分離所有代次的毒株。本試驗中試驗對象為9a5b株(強毒）。

1.2 載體和主要試劑 RPMI 1 640培養(yǎng)基、澳洲源胎牛血清購自Gibco公司;辣根過氧化物酶(HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG、熒光素(FITC）標(biāo)記山羊抗鼠IgG、胰蛋白酶購自 Sigma公司;預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購自 MBI公司;DAPI、β-actin單抗購自碧云天生物技術(shù)研究所;其他生化試劑分析純。

1.3 基質(zhì)蛋白(M）的原核表達及抗體制備 常規(guī)方法擴增病毒,Tirzol法提取病毒 RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)GenBank NDV核苷酸序列設(shè)計并合成引物,分別為PmF:GA GAATTC AAGATGGATTCATCTAG(Eco RⅠ）;Pm R:G GTCGAC TTACTTTTTGAACGGGT(SalⅠ）,總 長 度 為1 095 bp。RT-PCR擴增得到的特異性片段經(jīng)特異性酶切后與 pET-32a(+）載體連接,轉(zhuǎn)化 BL21(DE3）感受態(tài)細胞,鑒定陽性菌并誘導(dǎo)表達,37℃培養(yǎng)至OD600達 0.6～0.7,0.5 mmo l/L IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h,超聲波裂解后SDS-PAGE電泳,切割目的條帶,研磨后經(jīng)滅菌 PBS稀釋,按 50μg/只量免疫BALB/c小鼠,4免后采血分離血清,凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 NDV感染細胞的動態(tài)監(jiān)測 將DF1細胞接種35mm dish,待長至 70%左右時,以 5 m.o.i病毒量感染DF1細胞單層,于不同時間點福爾馬林室溫固定,4℃保存?zhèn)溆?。IFA檢測方法的簡要步驟如下:在固定的感染細胞飛片上,滴加1∶1 000稀釋的鼠源抗基質(zhì)蛋白的特異性多抗血清37℃作用30 min,0.01 mo l/L TBS洗滌 10 m in,加入1∶200稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗37℃作用30 min,0.01 mol/L TBS洗滌10 min,加入1∶500稀釋的DAPI 37℃作用5min,充分洗滌后,置于載玻片上利用正置熒光顯微鏡檢測。Western-blot檢測方法的簡要步驟如下:SDS-PAGE后,按常規(guī)方法進行免疫轉(zhuǎn)印,5%脫脂乳封閉過夜,加入 1∶1 000稀釋的鼠源抗基質(zhì)蛋白的特異性多抗血清,37℃作用 2 h后,經(jīng) 0.01 mol/L TBST洗滌10 min,加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG,37℃作用2 h,充分洗滌后,以ECL增強顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 NDV 9a5b毒株生長曲線 9a5b病毒按5 m.o.i量感染DF1細胞單層,每隔1 h收集細胞上清,測定TCID50,結(jié)果顯示,病毒感染1～16 h為對數(shù)生長期,其中1～4 h病毒增殖迅速,4～16 h較之前緩慢,16 h之后進入平臺期(圖1）。

2.2 M蛋白的原核表達和抗體制備 pET-M重組菌經(jīng)0.05 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后,SDSPAGE結(jié)果可見,基質(zhì)蛋白獲得高效表達(圖2A）,大小為54 kD左右,經(jīng)超聲波裂解后,SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組M蛋白以包涵體形式存在(圖2B）。2.3 M蛋白在不同感染時間點的細胞內(nèi)分布IFA檢測結(jié)果顯示,感染6 h時,M蛋白分布于細胞漿內(nèi),到8 h時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍的M蛋白逐漸增多,感染后12 h,M蛋白已聚集于細胞膜的內(nèi)側(cè),感染后16 h形成包涵體,M蛋白在細胞膜內(nèi)側(cè)形成明顯的斑點狀聚集,感染后24 h出現(xiàn)5～10個細胞膜融合的包涵體,M蛋白存在于包涵體膜的內(nèi)層(圖3）。

圖2 M蛋白的原核表達

圖3 不同感染時間M蛋白的細胞內(nèi)分布(40×）

Western-blot結(jié)果顯示,當(dāng)M蛋白抗體的稀釋度降低至1∶1 000,在感染9a5b后 8 h時,可通過免疫印跡檢測出M蛋白已開始明顯表達,隨著時間延長,含量則不斷增加(圖4）。

圖4 M蛋白的W estern-blot檢測

3 討論

基質(zhì)蛋白(M）是NDV目前研究最少的結(jié)構(gòu)蛋白[3]。在成熟的病毒子中,M蛋白位于病毒囊膜內(nèi)層,構(gòu)成病毒囊膜的支架,在RNA的合成和病毒的裝配上起重要的作用。王蕾等[4]研究表明,NDV基質(zhì)蛋白通過抑制宿主細胞表達固有促炎性因子,抑制了宿主的免疫應(yīng)答,促進了NDV在宿主內(nèi)的復(fù)制。Nipah病毒的基質(zhì)蛋白具備YPLGVG的基序,被證實是病毒出芽必需的組分。通過序列比對發(fā)現(xiàn),NDV M 蛋白編碼區(qū)中對應(yīng)的序列為:LCLGSV,這說明不同副黏病毒M蛋白的功能存在一定的差異[5]。

本研究利用原核表達產(chǎn)物制備的多抗血清進行M蛋白在細胞內(nèi)的定位分析,NDV 9a5b病毒按5 m.o.i感染量接種DF1單層細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在感染6 h后,M蛋白開始可見,且主要分布于細胞漿內(nèi),到感染后8h時,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍的M蛋白逐漸增多,這說明ND病毒主要蛋白的復(fù)制是從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)近核附件開始復(fù)制的,這一點并不難理解。核外周聚集了大量的游離核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體,因此,NDV的每種蛋白主要從這些部位開始向其獨特的位置轉(zhuǎn)運。感染12 h時,M蛋白已開始聚集于細胞膜的內(nèi)側(cè),而當(dāng)感染后16 h開始形成包涵體時,M蛋白在細胞膜內(nèi)側(cè)形成明顯的斑點狀聚集;當(dāng)感染至24 h時,逐漸出現(xiàn)5～10個細胞膜融合的包涵體,M蛋白存在于包涵體融合膜的內(nèi)層,且熒光強度已逐漸減弱(圖3）。這說明該病毒在24 h時基本上出芽結(jié)束,達到了生長的平臺期。這一推論在9a5b的生長曲線和Western-blot檢測結(jié)果中得到佐證(圖1、圖4）。這暗示NDV的M蛋白首先在細胞內(nèi)膜中高度聚集,與此處的HN和F囊膜蛋白的末端結(jié)合,并與NP和P包裹的RNA結(jié)合,從而組裝成完整的病毒粒子[5,7]。這亦暗示M蛋白與宿主細胞相互之間具有密不可分的關(guān)聯(lián)性。這將在下一步的試驗中加以證實。

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[3] Bruce S Seal,Daniel JK ing,Richard JMeinersmann.Molecular evolu tion of the New castle disease virus matrix protein gene and phy logenetic relationships am ong the paramyxoviridae[J].V irus Research,2000,66:1-11.

[4] 王蕾,陳福勇,鄭世軍,等.新城疫病毒(NDV）基質(zhì)(M）蛋白在體外對炎癥因子誘導(dǎo)的作用[J].中國獸醫(yī)雜志,2008,44(4）:14-15.

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