新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表達

楊紅軍,王豪舉

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,重慶北碚 400715;2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院,重慶北碚 400715）

雞新城疫(ND）1926年首次在印度尼西亞的爪哇和英國的紐卡斯?fàn)柊痤D暴發(fā)。該病是由新城疫病毒(NDV）引起的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類傳染病。ND的預(yù)防目前采用滅活苗和弱毒苗接種,但它干擾流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測,不利于控制ND的流行和傳播。也使應(yīng)用受到限制,但在世界范圍內(nèi)仍是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一[1]。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗(transgenic p lant vaccine）是把植物基因工程技術(shù)與動物機體免疫機理相結(jié)合,生產(chǎn)出能使動物機體獲得特異抗病能力的疫苗[2]。動物試驗已經(jīng)證實,轉(zhuǎn)基因植物表達的抗原蛋白經(jīng)純化后仍保留了免疫學(xué)活性,注入動物體后能產(chǎn)生特異性抗體;用轉(zhuǎn)基因植物組織飼喂動物,轉(zhuǎn)基因植物表達的抗原呈遞到動物的腸道淋巴相關(guān)組織,被其表面特異受體特別是M細胞所識別,產(chǎn)生黏膜和體液免疫反應(yīng)[3-9]。

本試驗通過 RT-PCR獲得新城疫病毒LaSota株血凝素-神經(jīng)氨酸苷酶(HN）基因,定向克隆到植物表達載體pBI121中,構(gòu)建了含有LaSota株HN基因的表達重組質(zhì)粒 pBI121-HN,并通過 SDSPAGE對其在苜蓿中表達進行了初步的探討,為利用植物作為生物反應(yīng)器奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒及NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;pMD-18-T載體和大腸桿菌DH 5α購自寶生物工程(大連）有限公司;AMV 反轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑RNasin,購自Promega公司;質(zhì)粒pBI121及根癌農(nóng)桿菌LBA 4404由西南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程中心惠贈。

1.2 病毒的增殖與純化 將NDV LaSota株接種于20枚9日齡雞胚,37℃孵育,無菌收取尿囊液。并測尿囊液血凝效價[11]。蔗糖密度梯度離心法純化病毒,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 新城疫HN基因的擴增 參照GenBank中的NDV HN(AF077761）基因高變區(qū)核苷酸序列,設(shè)計合成1對引物(P1:5′-atgaccaaaggacgatatacggg-3′和 P2:5′-cgccatgtcctacccgtattatt-3′）,引物由寶生物工程(大連）有限公司合成。病毒基因組 RNA用TRIAZOL RNA提取試劑盒,按說明書進行提取;反轉(zhuǎn)錄按Promega公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行。

1.4 HN基因的克隆和測序鑒定 將PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收后,與PMD-18-T載體進行 T-A克隆,連結(jié)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)酶切鑒定得到陽性克隆。重組質(zhì)粒pMD-18-T-HN核苷酸序列由寶生物工程(大連）有限公司測定。

1.5 重組表達質(zhì)粒pBI121-HN的構(gòu)建和鑒定 根據(jù)HN基因的下游序列設(shè)計 1條引物,P3:5′-agagctcgccttgtatctcattgccacttac-3′,由 寶生 物工 程(大連）有限公司合成,并引入 SacⅠ酶酶切位點;與通用引物M13,以pMD-18-T-HN為模板,擴增HN基因,經(jīng)XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后,定向克隆入表達質(zhì)粒 pBI121的相應(yīng)位點,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pBI121-HN,經(jīng)酶切和測序鑒定。

1.6 重組表達質(zhì)粒pBI121-HN轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌,并在苜蓿中的表達 用電穿孔法將重組表達質(zhì)粒pBI121-HN轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA 4404感受態(tài)細胞中,得到陽性克隆后,帶有重組表達質(zhì)粒pBI121-HN的根癌農(nóng)桿菌侵染苜蓿愈傷組織,將H N基因轉(zhuǎn)入苜蓿中,對再生植株提取總蛋白質(zhì),SDS-PAGE電泳后進行銀染,以及Western-blot分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與鑒定 病毒接種雞胚后,24 h內(nèi)死亡2枚(棄掉）,72 h內(nèi)死亡5枚,96 h死亡8枚,5枚未死,置冰箱凍死。尿囊液血凝價在1∶26～1∶211之間,且血凝性能被NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抑制。

2.2 HN基因的 RT-PCR擴增和克隆 用 TRIZOL試劑盒提取新城疫 LaSota株病毒基因組RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第一cDNA,以P1和P2為引物,經(jīng)PCR擴增出大小為2083 bp的片段(圖1）,與預(yù)期的片段長度相符,將PCR產(chǎn)物純化回收后,按常規(guī)方法與pMD-18-T連結(jié)轉(zhuǎn)化,經(jīng)XbaⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒(圖2）,挑取陽性克隆與進行測序鑒定,測序結(jié)果表明,擴增出2 083 bp的核苷酸中包含HN基因的完整閱讀框,核苷酸序列同源性達99%,氨基酸序列有2個氨基酸存在差異,均為點突變,對抗原結(jié)構(gòu)影響不大。

2.3 重組表達質(zhì)粒pBI121-HN的構(gòu)建和鑒定 重組表達質(zhì)粒pBI121-HN經(jīng)XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后電泳,出現(xiàn)2 083bb的插入片段和2.9 kb的載體條帶,與預(yù)期結(jié)果相符(圖3）,結(jié)果表明,HN基因已被正確插入表達載體pBI121中。

圖3 pBI121-HN酶切鑒定結(jié)果

2.4 重組表達質(zhì)粒pBI121-HN,在苜蓿中的表達

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pBI121-HN經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受細胞LBA 4404,篩選陽性克隆,侵染苜蓿組織。對5株再生植株提取總蛋白質(zhì),經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,3#、10#、15#和 34#共 4株在蛋白質(zhì)分子量64 kD處出現(xiàn)一條帶,與預(yù)期的目的蛋白質(zhì)大小相符,而對照苜蓿和20#植株沒有出現(xiàn)條帶(圖4）,以NDV多抗血清為一抗,H RP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,進行Western-b lot分析,結(jié)果在64 kD處出現(xiàn)條帶(圖5）,初步判定HN基因在苜蓿中已經(jīng)表達。

圖4 苜蓿蛋白質(zhì)SDS-PAGE結(jié)果

3 討論

對于新城疫這種烈性傳染病來說,用疫苗預(yù)防接種是首選方法。但傳統(tǒng)的疫苗接種往往受宿主和病毒兩方面的影響而使得免疫失敗,即宿主對病毒的免疫耐受力下降及病毒產(chǎn)生變異使宿主不能抵抗病毒的攻擊。1992年,Mason H S等[10]提出了用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗的新思路,從而開辟了一條用植物生產(chǎn)可食用疫苗的新途徑。其中利用苜蓿表達系統(tǒng)表達動物病原蛋白成本低、蛋白質(zhì)能夠正確折疊、具有口服安全等特點,備受國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注,到目前為止,人們應(yīng)用轉(zhuǎn)基因苜蓿作為表達病原抗原蛋白的異源表達載體,成功地表達了多種外源蛋白質(zhì)[11]。

本文表達載體pBI121-HN是將外源基因功能基因HN基因插入 Ti質(zhì)粒中,質(zhì)粒的CaMV 35S啟動子是組成型啟動子,可以啟動外源基因在植物染色體上的表達,HN基因自身帶有ATG啟始密碼子和TGA終止密碼子,通過檢測新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ）的正常表達,說明HN基因的插入并未破壞基因讀碼框,也可初步預(yù)測HN基因在植物染色體上的成功表達,因而構(gòu)建的pBI121-HN是一個有效的植物雙元表達載體系統(tǒng)。

通過苜蓿蛋白質(zhì)SDS-PAGE結(jié)果初步判定雞新城疫HN基因在苜蓿中已經(jīng)表達。利用植物作為載體來表達和傳遞疫苗的發(fā)展給免疫研究注入了新的內(nèi)容,在21世紀(jì)這個生物技術(shù)的世紀(jì)里,苜蓿作為傳統(tǒng)的重要牧草應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物疫苗的生產(chǎn),展示出了良好的應(yīng)用前景。

圖5 Western-blot檢測苜蓿中HN蛋白質(zhì)的表達

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