卵巢漿液性囊腺癌與交界性囊腺瘤的差異蛋白質(zhì)組學分析

張立會,王宏宇,劉紅燕,聶建國

（1.吉林大學第二醫(yī)院,吉林 長春 130041;2.根河市滿歸中心衛(wèi)生院,內(nèi)蒙古根河 022363）

卵巢惡性腫瘤發(fā)生率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占第3位,低于宮頸癌和子宮體癌,但死亡率卻最高。其中40%-50%為卵巢漿液性囊腺癌（Ovary serous cystadenocarcinoma,OSC）,最為常見。由于卵巢位置深在盆腔,早期癥狀不典型或無明顯癥狀,且缺乏早期有效可靠的診斷、治療及預后評價方法,這就使得卵巢癌的早期診斷率不高,70%的患者初診時已是晚期,預后差,5年生存率僅為20%左右;而在早期發(fā)現(xiàn)者經(jīng)過常規(guī)手術(shù)和化療,5年生存率可達90%。因此,篩選特異、敏感的腫瘤標志物對卵巢癌的早期診斷和預后具有重要意義。

蛋白質(zhì)組是指一個細胞、組織或機體的基因組所表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學是對蛋白質(zhì)組整體水平進行研究的一門新型技術(shù)。蛋白質(zhì)組學（proteomics）技術(shù)已達到細胞及亞細胞器蛋白質(zhì)組分析水平,可徹底闡明細胞所有的蛋白質(zhì)組分。使尋找用于臨床早期診斷的特異敏感的生物學標志物成為可能[1]。在卵巢癌的多方面研究中得到廣泛的應(yīng)用,如對卵巢癌發(fā)病機制的研究、卵巢癌腫瘤標志物（tumor marker,TM）的篩選、卵巢癌信號轉(zhuǎn)導通路的研究及協(xié)助診斷、協(xié)助卵巢癌分類、尋找治療靶點等。研究卵巢癌的發(fā)病機制、分類、治療方法,尤其是早期診斷（early diagnosis）,具有十分重要的意義,而與傳統(tǒng)方法相比,蛋白質(zhì)組學在腫瘤各方面研究中具有十分獨特的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 本研究選取吉林大學第二醫(yī)院婦科2008年4月-2008年12月收治的臨床上初次手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的卵巢漿液性囊腺癌患者6例（以下稱CA組）,卵巢交界性漿液性囊腺瘤6例（以下稱IN組）,已告知患者取組織學標本用途,并同意取材。手術(shù)標本均在30分鐘內(nèi)置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存。CA組年齡范圍為42-75歲,病理類型均為卵巢漿液性囊腺癌,臨床病理分期均為IIIc期。

1.2 實驗方法 把保存好的標本融化,放在無菌的培養(yǎng)皿中用磷酸鹽緩沖液沖洗,去除黏附的血紅蛋白和其他蛋白。然后把組織切成1mm3大小,放入液氮中研磨粉碎。再用裂解液溶解,同時加入DNA酶和RNA酶去除DNA和RNA。然后在100,000 g條件下離心1小時去不溶解成分。所有樣品用Bradford方法測定蛋白濃度后置-80℃保存。酶切前所有樣品用25mM NH4HCO3稀釋使尿素濃度低于2M。酶切時首先用20mM DTT在56℃條件下還原1小時,再在常溫下避光用50mM碘乙酰胺烷基化30分鐘,然后按 1∶50比例加入測序級胰酶37℃酶切過夜。酶切后樣品真空抽干后-80℃保存?zhèn)溆?。所有樣品用緩沖液A（0.1%甲酸）溶解后,應(yīng)用二維液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（two dimensional liquid chromatography mass Spectrometer/mass Spectrometer,2-DE LC-MS/MS）進行分析,每次實驗上樣量為50μg。強陽離子柱為150mm×0.32mm,反相柱為150mm×0.17mm,強陽離子柱的乙酸氨洗脫方法為12.5mM,25mM,50mM,75 mM,250mM和5M。反相柱洗脫方法為5-30%緩沖液B（0.1%甲酸,99.9%乙腈,流速為2 μL/m in）,洗脫時間為3小時。每個樣品做兩次實驗。經(jīng)反相色譜洗脫的多肽應(yīng)用LTQ XL質(zhì)譜儀檢測,質(zhì)核比檢測范圍為400-2000 amu,應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴方式進行次二級質(zhì)譜掃描（每次全掃描后做10次二級掃描,母離子質(zhì)核比寬度為3 amu,35%標準碰撞能量,動態(tài)排除時間為1.5min）。

1.3 數(shù)據(jù)處理 強度在10個單位以上、有10個以上離子信號的譜圖用SEQUEST算法和相關(guān)Bioworks 3.3.1 SP1軟件包進行數(shù)據(jù)庫檢索,鑒定出相關(guān)多肽和蛋白。蛋白數(shù)據(jù)庫為從歐洲生物信息學院網(wǎng)站（http://www.ebi.ac.uk/IPI/）下載的人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（3.58版）。相關(guān)檢索參數(shù)如下:多肽質(zhì)量誤差范圍為3 Da,半胱氨酸修飾為+57,完全酶切肽段,可以有兩個誤切位點。SEQUEST檢索后篩選參數(shù)如下:（1）Rsp=1;（2）在假陽性率為1%時,DeltaCn＞=0.2,Xcorr值在單電荷時為1.7,雙電荷時為3.2,三電荷時為3.3。

1.4 結(jié)果判定 本研究應(yīng)用兩次實驗中每個蛋白的譜圖數(shù)來評價其豐度。對于在不同樣品中豐度發(fā)生變化的蛋白,其譜圖數(shù)變化必須滿足以下原則:（1）兩個樣品中譜圖數(shù)的比值大于等于2。（2）兩個樣品中譜圖數(shù)的差值大于等于24（平均每次實驗差值為12）。為評價上述方法用于鑒別蛋白豐度變化的假陽性率,每個樣品的兩次實驗之間進行了相互比較分析,相應(yīng)假陽性率為1.4%。

2 結(jié)果

2.1 1D-PAGE結(jié)果 將為CA組、IN組的混合樣品酶切前后分別進行1D-PAGE（如圖1）,得出結(jié)果兩組間及酶切前后電泳條帶均有有差異,一方面說明這兩個樣品是有差異的,另一方面說明本酶切效率比較好,酶切后的肽段都在分子量10 KD以下。對酶切后樣品進行液質(zhì)聯(lián)用圖譜分析。

圖1 CA組、IN組的混合樣品酶切前后1D-PAGE結(jié)果

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果 從CA組、IN組的組織標本取得的2個混合樣品,液質(zhì)聯(lián)用分析都進兩次實驗。綜合兩次實驗結(jié)果,CA組織蛋白共計1 085個;IN組織蛋白共計585個。兩次實驗得出的譜圖數(shù)是相近的,說明本方法具有很好的重復性。根據(jù)差異蛋白判定原則,計算得出CA-IN組差異蛋白數(shù)為96個。

CA-IN組鑒定得出的96個差異蛋白譜中,有83個差異蛋白表達上調(diào);13個差異蛋白表達下調(diào)。這些差異蛋白主要包括細胞骨架蛋白、伴侶蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白、參與物質(zhì)及能量代謝的酶類、信號轉(zhuǎn)導、細胞周期、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)蛋白、免疫調(diào)節(jié)因子以及其他參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。蛋白分類構(gòu)成情況如圖2。

其中16個蛋白為細胞骨架成分,12個蛋白為伴侶蛋白,12個蛋白為細胞外基質(zhì)的組成成分,25個為參與物質(zhì)及能量代謝的酶類,3個參與信號轉(zhuǎn)導的蛋白分子,18個參與細胞周期、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)蛋白,4個免疫相關(guān)蛋白以及其他6種蛋白質(zhì)。

3 討論

由于卵巢癌早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)和有效的篩查方法,I期就明確診斷的患者僅僅占25%。因此卵巢癌的早期診斷在提高卵巢癌患者生存率上顯得尤為重要。

目前CA125是應(yīng)用最為廣泛的上皮性卵巢癌檢測標志物,在晚期上皮性卵巢癌中陽性率可達80%,但Ⅰ期卵巢癌患者僅50%-60%,單測CA125時其陽性預測值＜10%,輔助超聲檢測只有20%左右,因此不能用于卵巢癌早期診斷的常規(guī)篩查。

本實驗采用二維液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定了6例卵巢漿液性囊腺癌和6例卵巢交界性漿液性囊腺瘤組織的差異表達蛋白質(zhì)譜。為了降低實驗的假陽性率,兩個實驗樣品分別做兩次,綜合兩次實驗結(jié)果,根據(jù)差異蛋白的判定原則鑒定出96個唯一/成組差異蛋白。按照蛋白功能不同分為8類,其中一些蛋白與卵巢癌和（或）其它惡性腫瘤的關(guān)系比較明確,參與細胞間或細胞內(nèi)生物信號轉(zhuǎn)導、免疫調(diào)節(jié),促進腫瘤細胞的惡性增殖,加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中在不同時相、部位起著重要的作用。尚有其他一些差異蛋白與卵巢癌的關(guān)系尚未明確。

圖2 差異蛋白粉類構(gòu)成

3.1 細胞骨架蛋白

細胞骨架是指真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成。本實驗鑒定出3種肌動蛋白（胞質(zhì)肌動蛋白、人肌動蛋白素-1、骨骼肌肌動蛋白-1）,參與細胞的有絲分裂、信號傳導和細胞的運動,它的異常表達可能與腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲有關(guān)[3]。7種微管蛋白鏈（微管蛋白 α-1A 、β 、β-2A 、β-2C 、β-3 、α-4A 、A1B cDNA FLJ60097）,是 中心體的重要組成部分,參與染色體的運動、有絲分裂和細胞凋亡等。tubulin A、B蛋白正常排列的破壞及表達異常與腫瘤的惡性生物學行為密切相關(guān),其數(shù)量及形態(tài)在腫瘤細胞中均發(fā)生了變化,微管的聚合及解聚與惡性腫瘤的發(fā)生及增殖有關(guān)。2種網(wǎng)格蛋白（網(wǎng)格蛋白-1、網(wǎng)格蛋白重鏈-1）形成參與細胞內(nèi)吞的包被外殼和主要支架。3種肌球蛋白（肌球蛋白14重鏈3亞型、肌球蛋白-9:1亞型、肌球蛋白11）,肌球蛋白在胞質(zhì)分裂、細胞形態(tài)和某些功能如細胞分泌有重要作用,是決定細胞形態(tài)和功能的因素之一。

3.2 伴侶蛋白

是細胞受刺激后被誘導產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白。除熱損傷外,能由多種損傷因素誘導,具有維持細胞蛋白自穩(wěn)、調(diào)節(jié)細胞周期等多種重要功能。本實驗鑒定出10種HSP分型,（HSPA5、HSP 71 kDa、HSPA1B;HSPA1A 70 kDa、HSP 27kDa 、HSP60 kDa、HSP90-beta、HSP90B1:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)素、HSPA1L 70 kDa 、泛素樣活化酶-1、缺氧上調(diào)蛋白1（Hypoxia up-regulated protein 1,HYOU1）。有證據(jù)表明HSP家族可能通過抑制細胞凋亡來導致腫瘤形成[4]。

HSP27是一種與致癌作用明顯相關(guān)的HSP亞型,在多種惡性腫瘤中高度表達,包括生殖系統(tǒng)腫瘤。卵巢癌患者對Hsp27免疫應(yīng)答增強。因此HSP27-抗HSP27抗體的凝集試驗可能成為卵巢癌早期診斷的有用參數(shù)。HSP70在正常細胞中表達水平較低,而在應(yīng)激狀態(tài)下可顯著性升高。在病毒轉(zhuǎn)化和化學誘導的腫瘤細胞中,HSP70的表達顯著升高;并且對細胞凋亡有保護作用,其高表達可增強腫瘤細胞抗凋亡能力?？商崾旧掀ぐl(fā)育不良或惡變[4]。HSP90的抑制劑具有抗增殖和促進細胞凋亡的作用,有望成為癌癥化療藥。HYOU1在局部缺氧缺血和血管形成中有重要作用,在侵襲性前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌中表達增加,與淋巴管及淋巴結(jié)侵襲等因素有關(guān),認為HYOU1可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中起作用,并可提示預后不良。PDI是一種胰臟特有的糖基化蛋白質(zhì),可導致蛋白質(zhì)折疊錯誤。本實驗鑒定出PDI的A3亞型PDIA3。PDIA3是一種惡性腫瘤高遷移率蛋白,參與DNA片段破壞,可能成為新的化療藥物靶點[5]。

此外,PHB基因可能是一種抑癌基因,具有抗增殖活性。Jean等[6]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)在TOV-112D卵巢癌細胞系發(fā)現(xiàn)PHB呈高表達。

3.3 細胞外基質(zhì)

細胞外基質(zhì)（extracellu larmatrixc,ECM）是腫瘤轉(zhuǎn)移的組織屏障。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移常常伴有細胞外基質(zhì)及其細胞表面受體表達的變化。

本實驗鑒定出12種ECM類蛋白,其中膠原蛋白包括XIV型膠原蛋白α-1、VI型膠原蛋白α-3及它的3種前體。VI型膠原a-3的分布與腫瘤分化程度有關(guān),隨著分化程度的下降而減少,可能與腫瘤細胞通過蛋白水解酶降解基底膜有關(guān)。

糖蛋白在惡變細胞中,其結(jié)構(gòu)或含量發(fā)生改變。

FN在子宮內(nèi)膜癌中表達降低,與其侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,有望成為子宮內(nèi)膜癌進展指標[7]。FN分布與腫瘤分化程度有關(guān),分化差的癌巢周圍缺乏FN,可能與癌細胞分解基底膜有關(guān)。

VTN參與卵巢癌轉(zhuǎn)移的起始階段。VTN與整合素α（v）連接并相互作用促使卵巢癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移。VTN主要在肝臟合成,分布在正常卵巢上皮表面及分化的卵巢腺癌,在未分化腺癌組織中則不表達。VTN與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān),并可能有助于病理分型。

CLU作為凋亡抑制因子,在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Hough等[8]應(yīng)用cDNA芯片檢測發(fā)現(xiàn),卵巢癌細胞中Clu基因的mRNA表達明顯上調(diào),可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。SPON1在卵巢癌上皮表達,而正常卵巢中無表達,認為是一種潛在診斷的卵巢癌腫瘤標記物和新的治療靶點。

POSTN可能是一種有力的腫瘤促進劑,與其他基質(zhì)蛋白協(xié)引起腫瘤發(fā)生。這一過程先于腫瘤發(fā)展,成為潛在的診斷早期腫瘤的標志物[9]。

FMOD使腫瘤間質(zhì)增厚,增加細胞間隙液壓。給腫瘤細胞與血液之間建立屏障?？沙蔀榘邢蛑委煹奈稽c,提高實體惡性腫瘤化療療效。

DCN可以抑制多種組織來源的細胞生長。應(yīng)用免疫組化法及WESTERN-BLOT法未在卵巢癌中檢測到DCN,推測可能是在 DCN轉(zhuǎn)錄合成后被卵巢癌上皮細胞分泌酶類滅活[10]。

3.4 參與物質(zhì)及能量代謝的酶類

本實驗發(fā)現(xiàn)物質(zhì)能量代謝相關(guān)蛋白共有25種,主要包括糖酵解酶類、電子轉(zhuǎn)移的輔酶、合成蛋白質(zhì)酶類、ATP合成水解酶和GTP合成水解酶、核酸代謝相關(guān)酶類等。這些酶類的高表達符合惡性腫瘤代謝特點,在腫瘤診斷及治療方面有重要的作用。

Altenberg等[11]認為糖酵解途徑相關(guān)基因在超過70%的人類腫瘤病例中過表達。糖酵解異常活躍是惡性腫瘤物質(zhì)能量代謝的主要特征。

秒表時間研究法是一種最直接和較為可靠的研究工序作業(yè)時間的方法，就是用秒表對工序按照操作順序進行測定，測得多個周期時間之后，再求平均時間，作為單個周期的時間。這其實是一種抽樣法，就是用樣本推測總體，所以，對于每個工序需要測量多少組數(shù)據(jù)，才能較為合理，這非常重要。這里主要介紹誤差界限法：

其中線粒體蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)和天冬氨酸-蘋果酸穿梭體的重要組成部分;三羧酸循環(huán)中的一些重要酶類可能作為藥物的靶標,或用于發(fā)展疫苗。

本實驗鑒定出2種與核酸代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)。包括DNA依賴蛋白激酶催化亞基、葡萄球菌核酶區(qū)包含蛋白。其中DNA依賴蛋白激酶催化亞基,具有DNA水解酶功能。

3.5 信號轉(zhuǎn)導相關(guān)蛋白

粘液病毒抗性蛋白（Interferon-induced GTP-binding protein,Mx1）屬于大GTP酶的動態(tài)蛋白超家族,是由STAT信號傳導通路介導,由Ⅰ型IFN誘導的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,具有廣譜的抗病毒能力。SAMHD1具有跨膜結(jié)構(gòu)。K-sam是成纖維細胞生長因子受體家族成員,50%彌漫型胃癌存在K-sam的過表達。彌漫型胃癌中K-sam基因擴增與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移是有一定的聯(lián)系[12]。STAT1除介導正常細胞信號傳導外,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分關(guān)鍵的作用。許多腫瘤STAT途徑存在異常,導致細胞轉(zhuǎn)化、凋亡抑制。

3.6 細胞周期、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)蛋白

我們鑒定出參與細胞周期、轉(zhuǎn)錄、翻譯及調(diào)控的蛋白有18種。

組蛋白對染色質(zhì)的組裝和結(jié)構(gòu)形成起到重要作用。本實驗鑒定出7種組蛋白亞型。磷酸化組蛋白H2AX是DNA雙鏈斷裂的標志物[13],組蛋白H 1.3表達下調(diào),它在染色質(zhì)的包裝和活化方面具有非常重要的作用,對轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。抗磷酸化組蛋白-H 3抗體可標記細胞增殖分裂相;組蛋白類修飾與許多基因表達下調(diào)有關(guān),其中包括很多在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因。

過氧化物酶基因（peroxiredoxin-1,PRDX1）,參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導,是一種腫瘤抑制基因。

14-3-3蛋白（14-3-3 protein zeta/delta,YWHAZ）是一種銜接蛋白,Sinha[14]等應(yīng)用雙向電泳法研究耐藥的人類黑素瘤細胞系,發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白δ的高表達干擾伴侶蛋白系統(tǒng),影響轉(zhuǎn)錄機制,進一步研究有助于開發(fā)更有效的化療藥物。

本實驗檢測出4種EEF亞型:硫脲嘧啶-轉(zhuǎn)運體線粒體前體、EEF1A1、EEF1B2和延長因子 2。其中硫脲嘧啶翻譯延長因子在多種腫瘤中廣泛存在并高度表達。CTSD是一種肽鏈內(nèi)切酶,與多種惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。hn-RNPs可成為調(diào)節(jié)端粒長度的標靶[15]。核不均一核糖核蛋白M,核不均一核糖核蛋白C1/C2,在本實驗中表達上調(diào)。其中hnRNPC1/C2是細胞核中含量最大的蛋白質(zhì)之一,影響細胞增殖與分化。hnRNPM4,又被稱為癌胚抗原受體,位于巨噬細胞膜于與癌胚抗原結(jié)合后通過激活信號轉(zhuǎn)導途徑逃避細胞凋亡。

3.7 免疫調(diào)節(jié)因子

免疫抑制及免疫逃避是惡性腫瘤的發(fā)病機制之一,也是腫瘤免疫療法研究的熱點。本實驗發(fā)現(xiàn)4個免疫相關(guān)因子。

TAP1與鼻咽癌的發(fā)病有關(guān)。小劑量非復制腺病毒編碼的TAP1可誘導T細胞記憶,進而對腫瘤進行免疫應(yīng)答[16]。

GC屬胞外射線清除系統(tǒng),該蛋白存在于多種惡性腫瘤中,如乳腺癌,結(jié)腸癌,胰腺癌,前列腺癌等[17]。有研究認為該蛋白與絕經(jīng)后婦女低乳腺癌風險有關(guān)。

A1BG屬于免疫球蛋白超家族成員,是一種分泌血漿蛋白。Kreunin等人[18]使用糖蛋白檢測方法,在膀胱癌病人的尿的樣品中發(fā)現(xiàn)A1BG,但是在正常個體未檢測到。A1BG是一個與腫瘤相關(guān)基因,可能是一種潛在的腫瘤標記物。

IGHV3是一種免疫球蛋白重鏈片段,其多態(tài)性與大皰性類天皰瘡易感性有關(guān)。表達非突變狀態(tài)IGHV的多毛細胞白血病對克拉屈濱呈低反應(yīng)性,使病情惡化[19]。

3.8 其他腫瘤相關(guān)蛋白

A2M是一種血漿蛋白同時也是一種廣譜的蛋白酶抑制劑。它具有抑制腫瘤生長參與出凝血平衡和清除循環(huán)中內(nèi)源性及外源性蛋白水解酶等重要生理功能。

本實驗鑒定出三種亞型FGA、FGB和FGG均表達上調(diào)。卵巢癌患者磷酸化FGA血清水平提高[20]。FGB可抑制內(nèi)皮細胞對ECM的粘附,間接地抑制血管形成,推測其可能具有抗腫瘤效應(yīng)。FGG同樣具有抑制血管形成及腫瘤生長的功能。

綜上所述,我們的實驗將二維液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用到卵巢癌的研究中,這一方法便利、高效、重復性好;在樣品的選擇上,卵巢漿液性囊腺癌組織與卵巢交界性漿液腺瘤組織進行對比,有望發(fā)現(xiàn)癌形成初始過程中關(guān)鍵的致癌因子,有利于卵巢癌發(fā)病機制的探索,特異性的卵巢癌腫瘤標志物篩選。研究結(jié)果表明:二維液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是有效可行的,將有助于我們簡便快捷地篩選腫瘤標志物,可以從整體上闡述卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)的動態(tài)變化及相互作用網(wǎng)絡(luò),必將對探索卵巢癌的發(fā)病機制做出巨大貢獻;應(yīng)用于臨床,對卵巢癌的診斷、治療及預后評估有重要意義。

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