eNOS基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病合并高血壓相關(guān)性的研究

朱海超,于世軍,楊康鵑,朱玉琢*

（1.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室,吉林延邊 133000;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 遺傳系,吉林 長春 130021）

2型糖尿病合并高血壓是臨床常見的問題,合并高血壓機率高達(dá)30%-50%[1]。患者一旦出現(xiàn)高血壓病,并發(fā)癥有加重的表現(xiàn)。研究結(jié)果表明2型糖尿病合并高血壓時在糖代謝異常及壓力負(fù)荷的雙重刺激下,加重了左心室心肌肥厚和功能受損。與單純高血壓比較,高血壓并存糖尿病患者的左心室及左心室重量增大及主動脈增寬,患者心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常較單純高血壓和2型糖尿病時更復(fù)雜和更嚴(yán)重,患者心腦血管疾病發(fā)生率明顯高于單純糖尿病組患者[2-4]。而降低糖尿病患者的血壓可以降低腦卒中發(fā)生率的35%-40%、心肌梗死發(fā)生率的20%-25%及心衰發(fā)生率的50%[5]。因此,尋找和建立有效的糖尿病合并高血壓發(fā)病風(fēng)險預(yù)測和發(fā)病前診斷技術(shù),在臨床上具有重要實用價值。本研究旨在探討吉林地區(qū)漢族人內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因第7外顯子單核苷酸（G894T）多態(tài)性與糖尿病合并高血壓的關(guān)系,為臨床早期發(fā)現(xiàn)和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

本研究中所有2型糖尿病患者均來自吉林大學(xué)第一醫(yī)院的住院和門診患者,每個病人都根據(jù)1997年美國糖尿病協(xié)會（ADA）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)進行了嚴(yán)格的診斷。空腹血漿葡萄糖≥7.0mmol/L或隨機血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L或OGTT試驗2小時血糖≥11.1mmol/L,符合上述標(biāo)準(zhǔn)之一者,在次日復(fù)診仍符合三條標(biāo)準(zhǔn)之一者確診為2型糖尿病患者。高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO的標(biāo)準(zhǔn):收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90mmHg。有明確高血壓病史且長期服用降壓藥物者也包括在內(nèi)。所有病例按照糖尿病病人是否患有高血壓分為兩組,單純糖尿病患者組和糖尿病伴有高血壓組。單純糖尿病組患者共有 45人,男/女=17/28,平均年齡 48±8.54歲。糖尿病合并高血壓組患者共有35人,男/女=13/22,平均年齡 51±7.46歲。正常對照組 36例,平均年齡47±8.44歲均來自吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥理基地,均為吉林地區(qū)體檢的健康人?；颊呓M與對照組均為吉林地區(qū)漢族人,各研究對象間均無血緣關(guān)系。所有入選患者的一般情況及臨床資料見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 血樣采集 所有受試對象均于晨起空腹取靜脈血2m l,2%EDTA抗凝。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用DNA抽提試劑盒（Promega北京生物技術(shù)有限公司）快速抽提人外周血中白細(xì)胞基因組DNA,操作方法按說明書進行。

1.2.3 聚合酶鏈實驗 利用引物設(shè)計軟件Oligo6.0按照引物設(shè)計原則設(shè)計出引物。

eNOS基因第7外顯子894G→T位點引物:上游引 物:5′-CAAGGTGGAGAATGAGGAAAC-3′,下 游 引物:5′-CTTTAGAGGCTCAGGGATGGC-3′。 用 PCR 擴增儀,預(yù)變性為94℃,持續(xù)5min;繼之30個周期,每個周期中變性94℃持續(xù)1min;退火58℃持續(xù)2 min,延伸 72℃,持續(xù)2 min;循環(huán)結(jié)束后終末延伸72℃,持續(xù)10min。用BanII限制性內(nèi)切酶消化擴增產(chǎn)物,反應(yīng)采用20μl的反應(yīng)體系。加樣完畢將上述反應(yīng)液混合均勻,瞬時離心5 s。蓋好Eppendorf離心管,放入恒溫水浴鍋中,37℃水浴5 h。向管內(nèi)添加10×loading buffer（含1%SDS）2μl,使內(nèi)切酶變性以終止反應(yīng)。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳 用移液器取10μl酶切產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。（在80 V電壓下泳動30min）,溴化乙錠染色,在透射式紫外線燈下觀察檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計方法

觀察熒光帶并確認(rèn)讀取各樣本基因型,計算各組eNOS基因型頻率和等位基因頻率,然后經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗。各組間等位基因頻率比較用χ2檢驗。用SPSS10.0 forwindows軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 eNOS基因的各基因型鑒定 兩個位點不同等位基因的判別 894G→T位點:經(jīng)過PCR擴增的產(chǎn)物得到430 bp,經(jīng)過BanII內(nèi)切酶酶切后得到312 bp和118 bp兩個片段,是野生型基因GG;酶切后產(chǎn)物既得到430 bp又得到312 bp和118 bp三條片段是突變型雜合子GT;酶切產(chǎn)物只得到一條片段430bp,是突變型純合子TT,結(jié)果見圖1。

圖1 eNOS基因第7外顯子894G→T多態(tài)位點 Ban II酶切后2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 基因型頻率和等位基因頻率比較 eNOS基因第7外顯子894G→T位點單純糖尿病組（DM組）,糖尿病合并高血壓組（DM+HP組）和對照組（NC組）基因型頻率和等位基因頻率分布,見表2。

表2 eNOS基因第7外顯子894G→T位點基因型頻率和等位基因頻率分布

3 討論

一氧化氮合酶（eNOS）是生成NO的限速酶。一氧化氮合酶（eNOS）基因位于人染色體的7q35～q36區(qū),長約21kb,包括26個外顯子和25個內(nèi)含子?，F(xiàn)已證實的eNOS基因的多態(tài)位點有10個。包括:兩個微衛(wèi)星序列,兩個串聯(lián)重復(fù)序列,6個單核昔酸多態(tài)性位點。本研究關(guān)注第7外顯子單核苷酸（G894T）多態(tài)性多態(tài)性。

國內(nèi)外對eNOS基因G894T多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系存在著巨大的差異。而對eNOS基因G894T多態(tài)性與糖尿病合并高血壓的研究很少。本研究按有無高血壓分為糖尿病合并高血壓組（DM+HP）和單純糖尿病組（DM）時,基因型的分析揭示DM+HP組（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）較NC組（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%.）分布有明顯差異（P＜0.05）,T等位基因頻率亦有顯著差異（DM+HP組等位基因頻率分別為G型為72.9%,T型為27.1%NC組中等位基因頻率分別為G型為87.5%,T型為12.5%）而DM組（GG型66.7%,ID型28.9%,DD型4.4%）與DM+HP組（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）和NC組（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%）無明顯差異（P＞0.05）。T等位基因比較也是沒有差異（P＞0.05）。

[1]Sowers JR,Ep steinM.Diabetesmellitusand associated hypertension,vascular disease,and nephropathy:an update[J].Hypertension,1995,26（8）:869.

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