非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)內(nèi)皮干細(xì)胞的檢測(cè)及其臨床意義

劉世國(guó),陳 鵬,鄭 紅,嚴(yán)春潮,吳 瓊,龔 菲,岑千紅

（湖北省中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢 430033）

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一類(lèi)來(lái)源于骨髓、增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤靠血管新生來(lái)獲得其脈管系統(tǒng),其機(jī)制是通過(guò)已有的毛細(xì)血管形成新生血管[1]。然而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤也可以通過(guò)骨髓來(lái)源的EPCs分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞后進(jìn)一步形成腫瘤血管[2,3]。研究表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞在腫瘤機(jī)體內(nèi)的含量明顯增高,其水平與活性與腫瘤的進(jìn)展和治療相關(guān)。因此,這些內(nèi)皮干細(xì)胞在腫瘤形成中的作用及腫瘤治療中的監(jiān)測(cè)成為腫瘤研究的新領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集我院2008年9月至2009年8月期間非小細(xì)胞肺癌患者的外周血,采集血液標(biāo)本時(shí)用EDTA抗凝管。其中,非小細(xì)胞肺癌患者組共45例,男性30例,女性15例,年齡53-84（61.3±7.5）,健康對(duì)照組15例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

人纖維連接蛋白購(gòu)于Chemicon公司;EBM-2培養(yǎng)基、SingleQuots組合添加劑購(gòu)自Clonetics公司;Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）購(gòu)于Molecular probes公司。ADMA,FITC標(biāo)記荊豆凝集素I（FITC-UEA-I）,購(gòu)于Sigma公司。PE-CD133,PEKDR購(gòu)于德國(guó)MACS;TR IZOL購(gòu)于晶美公司;optiL-yse C購(gòu)于Sigma公司。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs

在100μl含EDTA的外周血中加入Phycoerythrinconjugated anti-human VEGFR2（R&D systems）、或 biotin-conjugated anti-human CD133（Miltenyi Biotec）4℃反應(yīng)30分鐘,然后加入2ml紅細(xì)胞裂解液處理20分鐘,用PBS洗滌。在CD133的反應(yīng)管中繼續(xù)加入streptavidin-PECy5（BD Biosciences）反應(yīng)30分鐘。同時(shí)取100μl的外周血加入相應(yīng)熒光素標(biāo)記的抗體作為同型對(duì)照,具體操作步驟同上。在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 Real-time RT-PCR檢測(cè)EPCs標(biāo)記分子

將外周血用紅細(xì)胞裂解液（Sigma,Munich,Germany）裂解15分鐘,離心后去掉上清,根據(jù)說(shuō)明用Trizol reagent（Life Technologies）提取總RNA。其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為10μl,5xPrime Script Buffer 2μl,Prime Script RTEnzyme 0.5 μl,oligo dT 0.5 μl,Random 6mers 0.5 μl,total RNA 4 μl,加 RNase Freed H2O 至總體積10μl。37℃15min,85℃5 s。CD133上游引物序列為 5′-GCAATCTCCCTGTTGGTGAT-3′和下游引物 5′-CGCCTTGTCCTTGGTAGTGT-3′,VEGFR2 上 游引物序列為 5′-CACCACTCAAACGCTGACATGTA-3′和5′-GCTCGTTGGCGCACTCTT-3′。內(nèi)參 β-actin 的上游引物為 5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′和下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 熒 光 定 量PCR反應(yīng)體系總體積25μl,包括上游引物（10μmol/L）0.5μl,下游引物（10μmol/L）0.5μl,2xSYBR Premix Ex TaqTM 12.5μl,模板 cDNA 溶液2μl,反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化最后確定為:預(yù)變性95℃10 s,1個(gè)循環(huán);95℃5 s,55℃20 s,72℃12 s,40循環(huán)。

1.5 內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

取外周血2 0m l,注入已加EDTA的抗凝離心管,搖勻,4 h內(nèi)處理標(biāo)本。采集到的外周血20m lPBS對(duì)倍稀釋混勻。加入到淋巴細(xì)胞分離液。加入時(shí)小心與淋巴細(xì)胞分離液保持一界面,以2 000 r/min離心20min。離心后吸出灰白色的單個(gè)核細(xì)胞,小心吸取第二層乳白色液體于離心管中,并加以PBS液洗細(xì)胞,再以2 000 r/min離心3次。用吸管吸取上清,EGM-2 culturemedium（Clonetics Inc）,以2×106/ml濃度接種在用已用100μg/L纖維連接蛋白包被的6孔板中。第4天和第7天更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入5μg/m l的DiI-Ac-LDL,37℃孵育3小時(shí),用PBS洗滌。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10分鐘。浸洗,將FITC-UEA-1（10mg/L）加于上述標(biāo)本,于37℃下孵育1小時(shí)。在熒光顯微鏡下觀(guān)察并照相記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌患者及健康人外周血EPCs的含量的檢測(cè)

雖然到目前對(duì)EPC還沒(méi)有明確的概念,根據(jù)最近幾年的研究,我們用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD133+和VEGFR2+表達(dá)情況,并把CD133+和VEGFR2+雙陽(yáng)性細(xì)胞確定為EPCs（見(jiàn)圖1A）。在健康對(duì)照組中,外周血中EPCs的數(shù)量為（435±58.5）/ml,在非小細(xì)胞肺癌患者EPCs的數(shù)量為（1,365.4±225.6）/m l,相對(duì)于對(duì)照組大幅提高（P＜0.01）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血EPC數(shù)量

2.2 用real-time RT-PCR檢測(cè)EPC表面特異性標(biāo)記分子

CD133和VEGFR2是EPC表面的特異性標(biāo)記分子,為了進(jìn)一步從RNA水平檢測(cè)其表達(dá)量,其相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式為:目的基因的相對(duì)表達(dá)水平=2-△△CT,△△CT=△CT（sample）-△CT（control）,△CT（sample）=CT（target gene）-CT（β-actin）。通過(guò)real-time RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌患者外周血中CD133mRNA水平是是正常對(duì)照的3.2倍（P＜0.01）。VEGFR2的mRNA水平是正常對(duì)照的4.5倍,（P＜0.01）。

2.3 EPCs的染色與鑒定

從患者外周血分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用acLDL-DiI和UEA-I對(duì)細(xì)胞染色后,通過(guò)共熒光顯微鏡鑒定,細(xì)胞攝取FITC-UEA-1后顯綠色熒光（圖3A）,發(fā)紅色熒光的為acLDL-DiI陽(yáng)性細(xì)胞（圖3B）,acLDL-DiI和UEA-I雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs（圖3C）。

（P＜0.01,vs the controlgroup）圖2 外周血中CD133和VEGFR2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

A:EPCs combined with FITC-UEA-1;B:EPCs combined with Dil-acLDL;C:Mergeof FITC-UEA-1 and Dil-acLDL.圖3 EPCs的 Dil-acLDL和 FITC-UEA-1染色

3 討論

血管生成在腫瘤的進(jìn)展中至關(guān)重要,當(dāng)一個(gè)腫瘤組織生長(zhǎng)達(dá)到一定體積時(shí),其微環(huán)境已不能滿(mǎn)足腫瘤生長(zhǎng)所需求的營(yíng)養(yǎng),此時(shí)會(huì)誘使腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)所謂的“血管形成開(kāi)關(guān)”[4],通過(guò)促使原血管生成蛋白的表達(dá),使原先存在的毛細(xì)血管擴(kuò)散,導(dǎo)致新血管形成。有研究發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的外周血EPCs在腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用[5-7],最近有多組研究在人類(lèi)腫瘤血管中發(fā)現(xiàn)了CD133的EPC,且多種腫瘤患者外周血中EPC的水平上升,如、肝癌[8]、乳腺癌[9]、淋巴瘤[10]等。故將EPC作為評(píng)估惡性腫瘤診斷和治療效果的一個(gè)可考慮應(yīng)用的候選標(biāo)志物。雖然對(duì)CEPs還沒(méi)有明確的定義,外周血中的血管內(nèi)皮細(xì)胞及其前體細(xì)胞的鑒定,同樣借助于細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志。EPC表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 （VEGFR）,VE-cadherin、CD31、CD34、CD146等。目前較公認(rèn)的 EPC為CD133+CD34+VEGFR2+細(xì)胞,而隨著EPC發(fā)育為成熟內(nèi)皮細(xì)胞,CD133表達(dá)逐漸下降。因此,CD133是EPC獨(dú)特的細(xì)胞標(biāo)志物,可以用于EPC與成熟內(nèi)皮細(xì)胞的鑒別[11]。因此,我們選擇CD133、VEGFR2作為CEPs的表面標(biāo)志。

本研究檢測(cè)了45例非小細(xì)胞肺癌患者及15例正常人外周血中的CEPs,通過(guò)用acLDL-DiI和UEA-I對(duì)細(xì)胞染色后,熒光顯微鏡檢測(cè)證實(shí)了外周血中CEPs的存在;流式細(xì)胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者CEPs含量高于正常對(duì)照組（P＜0.01）,為進(jìn)一步證實(shí)非細(xì)胞肺癌患者外周血中CEPs含量的差異,我們用Real-timeRT-PCR檢測(cè)EPCs標(biāo)記分子CD133和VEGFR2表達(dá)水平。其結(jié)果顯示,和正常對(duì)照組比較,EPCs標(biāo)記分子表達(dá)量均有不同程度的增高。因此在監(jiān)測(cè)和診斷非小細(xì)胞肺癌時(shí)EPC有可能作為一種新的輔助診斷工具,同時(shí)該研究為今后將EPCs作為預(yù)后和預(yù)測(cè)化療之后附加的抗血管治療效果的一個(gè)選擇性標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

[1]Timar J,Dome B,Fazekas K,et al.Angiogenesisdependent diseases and angiogenesis therapy[J].PatholOncol Res,2001,7:85.

[2]Davidoff AM,Ng CY,Brown P,etal.Bonemarrowderived cells contribute to tumor neovasculatureand,whenmodified to expressan angiogenesis inhibitor,can restrict tumor growth inmice[J].Clin Cancer Res,2007,7:2870.

[3]Bolontrade MF,Zhou RR,Kleinerman ES.Vasculogenesisplays a role in thegrowth of Ewing's sarcoma in vivo[J].Clin Cancer Res,2002,8:3622.

[4]Naumov GN,Bender E,et al.A modelof hum antumor dormancy:an angiogenic switch from thenonangiogenic phenotype[J].JNatlCancer Inst,2006,98（5）:316.

[5]Davidoff AM,Ng CY,Brown P,et al.Bonemarrowderived cells contribute to tumor neovasculature and,whenmodified to expressan angiogenesis inhibitor,can restrict tumor growth in mice[J].Clin Cancer Res,2001,7:2870.

[6]BolontradeMF,Zhou RR,Kleinerman ES.Vasculogenesis plays a role in the growth of Ewing's sarcoma in vivo[J].Clin Cancer Res,2002,8:3622.

[7]Natori T,Sata M,Washida M,et al.G-CSF stimulates angiogenesis and promotes tumor growth:potential contribution of bonemarrow-derived endothelialprogenitor cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,297:1058.

[8]Yu D,Sun X,Qiu Y,etal.Identification and clinicalsignificance ofmobilized endothelial progenitor cells in tumor vasculogenesis of hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2007,13:3814.

[9]FurstenbergerG,von Moos R,Lucas R,et al.Circulating endothelial cells and angiogenic serum factors during neoadjuvant chemotherapy of primary breast cancer[J].Br JCancer,2006,94:524.

[10]Igreja C,Courinha M,Cachaco AS,et al.Characterization and clinical relevance of circulatingand biopsy-derived endothelialprogenitor cells in lymphoma patients[J].Haematologica,2007,92:469.

[11]Hristov M,ErlW,Weber PC.Endothelialprogenitor cells:Mobilization,diff erentiation,and homing[J].Art erioscler T hromb Vasc Biol,2003,23:1185.