重金屬鎘單克隆抗體的制備

郝亞明,周 玉,盧士英,任洪林,李巖松,柳增善,劉文迪,宋 芳

（人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130062）

重金屬對環(huán)境及人類存在潛在的持續(xù)的毒害作用,建立一種規(guī)范的程序,對重金屬實(shí)施有效的監(jiān)測[1]。傳統(tǒng)的重金屬檢測方法多采用化學(xué)方法檢測,如原子吸收光譜分析（atomic abs orption spectroscopy,AAS）、電感耦合等離子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma atom ic emission spectroscopy,ICP-AES）等,這些方法需要大量的樣品預(yù)處理,無法用于現(xiàn)場檢測,費(fèi)用高和檢測時(shí)間長等缺陷,難以適應(yīng)環(huán)境及市場產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查[2]。免疫學(xué)檢測具有檢測速度快、費(fèi)用低、儀器易攜、靈敏度高和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過制備重金屬鎘的單克隆抗體為鎘免疫學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Balb/c小白鼠,雌性,6-8周齡,購于長春生物制品研究所;SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞,為本實(shí)驗(yàn)室保種傳代。

1.2 試劑

牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）、卵清白蛋白（Albumin Egg OVA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）:美國Sigma-Aldrich公司;l-（4-硫氰根芐基）乙二胺四乙酸（1-（4-Isothiocyanobenzyl）ethylenediamine N,N,N',N'-tetraacetic acid,ITCBE）:日本同仁化學(xué)研究所;氯化鎘（CdCl2·2H2OCadm ium Chloride AR）:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 鎘離子完全抗原的制備

稱取4.0mg BSA溶于4.0ml硼酸鹽緩沖（0.01 M pH 9.0）中,緩慢滴加2 mg ITCBE（溶于200m l DMSO中）,邊滴加邊震蕩,于25℃,100 r/min的搖床中作用24 h,用透析袋（截留分子量14 000）進(jìn)行透析,去除未與 BSA結(jié)合的 ITCBE,得 ITCBE-BSA。ITCBE-BSA溶液用1M的HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0,再緩慢逐滴滴加100μl10mM的CdCl2溶液,邊滴邊振蕩,以免鎘離子使蛋白變性產(chǎn)生沉淀,將溶液在25℃,100 r/min的搖床中作用24 h,然后用處理好的透析袋進(jìn)行透析,除去未結(jié)合的鎘離子,得完全抗原Cd-ITCBE-BSA,將于-20℃保存。同樣方法制備Cd-ITCBE-OVA,合成路線見圖1所示。

圖1 鎘離子人工抗原的合成

2.2 鎘離子完全抗原的鑒定

2.2.1 鎘離子完全抗原的SDS-PAGE鑒定 配制SDS-PAGE 5%濃縮膠和 10%分離膠,樣品煮沸5 min,進(jìn)行電泳,上樣量為20μl（0.5mg/mL）,待指示劑距離分離膠底端1 cm時(shí),關(guān)掉電源?？捡R斯亮蘭染色液染色4 h,乙酸-乙醇脫色液脫色,用UVI-凝膠自動成像系統(tǒng)拍照。

2.2.2 鎘離子完全抗原的紫外分光光度法鑒定以0.01M pH 9.0的硼酸鹽緩沖液稀釋等量（以蛋白量計(jì)算）的載體蛋白、ITCBE-載體蛋白、重金屬-ITCBE-載體蛋白,在220-450 nm波長范圍進(jìn)行掃描（GBCCintra 303紫外分光光度計(jì)）。

2.3 小鼠的免疫

100μl Cd-ITCBE-BSA與等量的弗氏完全佐劑混合乳化。足墊注射免疫,50μl/只（0.5mg/mL（按蛋白量算））,免疫三只。一周后第二次免疫,免疫抗原與等量的弗氏不完全佐劑混合乳化,每只小鼠注射30μl（0.5mg/ml（按蛋白量算））的劑量。二免后5-7 d,小鼠斷尾采血,檢測效價(jià)。

2.4 檢測小鼠的血清效價(jià)

用Cd-ITCBE-OVA包被酶標(biāo)板,利用間接ELISA法檢測小鼠血清效價(jià),具體步驟參見文獻(xiàn)[3]。讀取OD490值,效價(jià)達(dá)到1∶3 200以上,進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.5 細(xì)胞融合

2.6 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆

融合后第10-12 d,待細(xì)胞增殖到96孔細(xì)胞板的1/15-1/10時(shí),用間接ELISA方法檢測細(xì)胞上清液,篩選出陽性細(xì)胞株。采用有限稀釋法將陽性雜交瘤細(xì)胞克隆化,直到陽性率達(dá)到100%時(shí)為止。

2.7 單抗的制備

采用體內(nèi)誘生法制備腹水。小鼠腹腔注入優(yōu)級滅菌液體石蠟,350μl/只,5-7 d后,將雜交瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1-5×106個/m l,每只小鼠注射0.5 ml。經(jīng)過10 d左右待小鼠腹腔鼓脹時(shí),收集腹水,5 000 r/min離心20min,取上清,-20℃凍存。

2.8 腹水的純化

利用親和層析法純化腹水。結(jié)合緩沖液稀釋腹水,流經(jīng)親和層析柱時(shí),目的蛋白會與親和柱內(nèi)的蛋白G結(jié)合,而雜蛋白隨著結(jié)合緩沖液流出體系;再用洗脫緩沖液把目的蛋白洗脫,超濾濃縮,-20℃保存。然后對純化的腹水進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,檢測純化腹水的效價(jià)。

3 結(jié)果

3.1 鎘離子完全抗原的鑒定

3.1.1 鎘離子完全抗原的SDS-PAGE鑒定 載體蛋白、ITCBE-載體蛋白、重金屬-ITCBE-載體蛋白的分子量越來越大,而遷移速率逐漸變慢,初步證明完全抗原制備成功。鑒定結(jié)果見圖2,3。

圖3 鎘免疫抗原的SDS-PAGE圖

3.1.2 鎘離子紫外分光光度法的鑒定 紫外分光光度法顯示:載體蛋白BSA與OVA的最大吸收峰值分別為278 nm和279 nm;空載體ITCBE-BSA、ITCBEOVA的最大吸收峰值分別是268 nm和269 nm;免疫抗原Cd-ITCBE-BSA和檢測抗原Cd-ITCBE-OVA的最大吸收峰值分別259 nm和275 nm。載體蛋白、螯合劑-載體蛋白以及重金屬-螯合劑-載體蛋白三者不僅最大吸收峰值發(fā)生了漂移,而且三者的波形也發(fā)生了變化,從而進(jìn)一步證明了完全抗原制備成功。結(jié)果如圖4、5所示。

圖4 鎘免疫抗原紫外掃描圖

圖5 鎘檢測抗原紫外掃描圖

3.2 小鼠血清效價(jià)的檢測

小鼠足墊免疫12-14 d后,利用間接ELISA檢測血清效價(jià),達(dá)6 400,符合細(xì)胞融合的要求。

3.3 細(xì)胞融合、篩選與克隆化

選擇血清效價(jià)最高的小鼠做細(xì)胞融合。融合率達(dá)到80.46%,如表1所示。融合后12 d左右,采用間接ELISA法篩選出11株陽性細(xì)胞,選擇OD490值高的、針對Cd2+的、僅有一個細(xì)胞集落的細(xì)胞株進(jìn)行克隆,經(jīng)過3次克隆后陽性率達(dá)到100%,最終選此細(xì)胞株,命名為5E12,擴(kuò)大培養(yǎng),凍存。如表2所示。

表1 細(xì)胞融合與篩選結(jié)果

表2 雜交瘤細(xì)胞三次克隆結(jié)果

3.4 腹水的純化

利用親和層析柱純化腹水,按照AKATA純化系統(tǒng)設(shè)計(jì)程序進(jìn)行純化,結(jié)果顯示流川峰值很高,絕大多數(shù)雜蛋白被排除;目的蛋白只有一個峰,說明洗脫很徹底。結(jié)果如圖6所示。

圖6 腹水純化的親和層析

3.5 腹水純化的SDS-PAGE鑒定

純化后的腹水進(jìn)行SDS-PAGE電泳,可見清晰兩條帶,一條為重鏈,另一條為輕鏈,而且僅有兩條帶,得到了比較純的單抗。結(jié)果如圖7所示。

圖7 腹水純化SDS-PAGE圖

3.6 腹水純化后的效價(jià)

采用間接ELISA法檢測純化后的腹水,結(jié)果顯示單克隆抗體5E12的腹水效價(jià)可達(dá)6.4×104,結(jié)果見圖8。

圖8 腹水型單抗5E12的檢測

4 討論

鎘離子是小分子物質(zhì),不具有免疫原性,屬于半抗原,不能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,需要與大分子載體蛋白偶聯(lián)才能達(dá)到免疫動物的要求。半抗原與載體連接時(shí),應(yīng)選擇合適的方法,選擇偶聯(lián)方式應(yīng)考慮半抗原的溶解度、穩(wěn)定性、結(jié)合鍵的位置以及適合的偶聯(lián)試劑等因素[4]。本研究選擇雙功能螯合劑ITCBE作為鎘離子與載體蛋白BSA的偶聯(lián)橋梁,完成了完全抗原的偶聯(lián)。免疫的目的是使B細(xì)胞在抗原的刺激下分化、增殖,有利于細(xì)胞融合形成雜交瘤,尤其是增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的幾率[5]。血清效價(jià)的高低與免疫次數(shù)及抗原劑量有很大的關(guān)系[6]?？乖瓌┝刻〔荒艹浞执碳C(jī)體的免疫系統(tǒng),免疫應(yīng)答弱,不會產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體;抗原劑量太大可能會引起實(shí)驗(yàn)動物的免疫耐受,而且可能導(dǎo)致動物死亡[7-9]。免疫次數(shù)太少達(dá)不到免疫效果,不利于特異性抗體的產(chǎn)生;而免疫次數(shù)太多會對皮膚造成不同程度的損傷潰瘍,造成微生物的感染從而與目的蛋白競爭免疫活性細(xì)胞,致使抗體量減少[10-12]。同時(shí)由于載體蛋白的免疫原性很強(qiáng),抗原量太多,免疫次數(shù)太多,抗血清中針對載體蛋白的抗體占明顯優(yōu)勢,針對小分子的抗體就會減少,不利于后期特異性單抗的篩選[13]。本研究采取足墊免疫,只免疫兩次就足夠刺激局部免疫系統(tǒng),血清效價(jià)可達(dá)6 400以上。

影響細(xì)胞融合的因素主要有:第一,環(huán)境溫度一般要控制在28-30℃,用PEG作用細(xì)胞時(shí),細(xì)胞很脆弱,此時(shí)的環(huán)境溫度不宜過低;第二,試驗(yàn)的所有試劑均要提前預(yù)熱,尤其是PEG一定要在37℃中保溫;第三,pH值的影響,基礎(chǔ)培基RPM I1640的pH值要控制在7.0-7.4之間,太高太低均會影響融合率,PEG的pH值要控制在7.4-7.8之間;第四,PEG作用時(shí)間,PEG對細(xì)胞有毒害作用,作用時(shí)間太長導(dǎo)致細(xì)胞死亡,一般PEG作用時(shí)間為1min;第五,生物膜的流動性與溫度成正比,在細(xì)胞可承受的溫度范圍內(nèi)適當(dāng)提高融合溫度有利于提高融合率,因此水浴溫度要保持在39℃;第六,離心時(shí)轉(zhuǎn)速不宜過大、時(shí)間不宜過長,細(xì)胞經(jīng)PEG作用后很脆弱,離心會對細(xì)胞造成機(jī)械損傷[14];第七,在每一步保質(zhì)保量完成的同時(shí),要盡量快,一方面降低了污染的幾率,另一方面也有利于細(xì)胞保持活力,提高融合率。

5 總結(jié)

免疫檢測方法所依賴的重金屬-螯合劑-載體蛋白復(fù)合物單克隆抗體的制備技術(shù)已經(jīng)成熟 。本研究成功獲得了抗重金屬鎘離子的單克隆抗體,為研制相應(yīng)的ELISA檢測方法和其它免疫檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。有望為快速、靈敏、低成本、現(xiàn)場檢測樣品中的重金屬提供一條可行的途徑。

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