膿毒癥大鼠腸道及腹水中菌群變化研究

劉大全,李東華,劉洪斌,宗春輝,高巧營

（天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所,天津 300100）

膿毒癥（Sepsis）是創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染、大手術(shù)后等臨床急危重病患者的常見嚴(yán)重并發(fā)癥之一,是感染引起的一種嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）[1-4]。另一方面,微生態(tài)學(xué)（microecology）是研究正常微生物群與宿主相互關(guān)系的生命科學(xué)分支,是微觀層次的生態(tài)學(xué),即細(xì)胞或分子水平的生態(tài)學(xué)。而腸道微生態(tài)學(xué)研究的主要內(nèi)容是腸道正常微生物群與宿主和環(huán)境構(gòu)成的相互作用、相互制約的微生態(tài)系客觀規(guī)律。近幾年的研究成果證明,離開腸道微生態(tài)學(xué),對消化道生理、病理學(xué)的研究其結(jié)論必定是不完整的,也是不科學(xué)的不準(zhǔn)確的[5]。當(dāng)機體發(fā)生腸穿孔、腹膜炎進而引起膿毒癥時,其胃腸道內(nèi)的正常菌群必定發(fā)生相應(yīng)的變化,致病菌本身或其代謝產(chǎn)物會參與全身的炎癥反應(yīng),繼而引起多器官功能障礙綜合癥（MODS）等嚴(yán)重后果。本研究運用熒光定量PCR和細(xì)菌培養(yǎng)的方法觀察病理狀態(tài)下動物模型腸道及腹水內(nèi)的菌群變化情況,試圖從微生態(tài)的角度進一步闡述膿毒癥的發(fā)病機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,體重210-230 g,由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供,動物合格證號SCXK（京）2005-0004。

1.2 主要試劑與儀器 糞便DNA提取試劑盒（QIAGEN美國）,普通PCR用Taq酶、熒光定量PCR試劑盒（均為北京天根生化科技有限公司）,細(xì)菌培養(yǎng)皿、細(xì)菌生化鑒定試劑盒（均為天津金章科技發(fā)展有限公司）,厭氧培養(yǎng)袋（梅里埃公司法國）;IQ5型熒光定量PCR儀（BIO-RAD美國）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 前期研究表明:盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后72 h動物模型的死亡率在50%-70%之間[6],故將Wistar大鼠60只,隨機分為假手術(shù)組（20只）、模型組（40只）。

1.3.2 模型制作 參照Wichterman等[7]的盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）方法,實驗前12 h禁食、不限水,以10%水合氯醛按1 mL/kg劑量進行腹腔注射麻醉,無菌條件下開腹,分離盲腸,在距其末端2 cm處以1號絲線結(jié)扎,再用18號針頭在盲腸末端穿孔2處,將盲腸放回腹腔后逐層關(guān)腹。假手術(shù)組于分離盲腸末端時,不進行結(jié)扎、穿孔。

1.3.3 標(biāo)本取材與處理 造模72 h后,各組動物在無菌條件下開腹,取腹水進行細(xì)菌培養(yǎng)（如動物腹腔內(nèi)無腹水,則注入2ml無菌生理鹽水進行腹腔灌洗,然后取灌洗液進行細(xì)菌培養(yǎng)）,同時留取結(jié)腸內(nèi)容物,使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3.4 腹水細(xì)菌培養(yǎng) 取500μl腹水（或灌洗液）作為原液,用無菌生理鹽水進行10倍的倍比稀釋,將不同濃度的菌液分別接種于需氧培養(yǎng)皿（包括血瓊脂培養(yǎng)皿、苯乙醇培養(yǎng)皿、麥康凱培養(yǎng)皿等）和厭氧培養(yǎng)皿上（厭氧培養(yǎng)皿放置于厭氧培養(yǎng)袋中）,分別在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后選擇適當(dāng)?shù)南♂尪壬仙L的菌落進行鏡檢、耐氧試驗和微量生化反應(yīng)試驗,以鑒定細(xì)菌的類型。

1.3.5 常規(guī)PCR反應(yīng) 參照文獻[8]并結(jié)合使用引物設(shè)計軟件,針對雙歧桿菌、乳桿菌、大腸埃希菌、脆弱類桿菌和糞腸球菌的16SrRNA序列設(shè)計特異性引物（見表1）。PCR反應(yīng)體系為25μl,其中DNA模板2μl,上下游引物（濃度為 25 pmol/μl）各 1 μl,10×Buffer2.5μl,dNTP 2μl,Taq 酶0.5μl,水16 μl。反應(yīng)程序為:94℃變性4min后,94℃30 s,50℃（或55℃）30 s,72℃30 s共32個循環(huán),最后以72℃10 min延伸后結(jié)束。經(jīng)試驗摸索,大腸埃希菌、雙歧桿菌和脆弱類桿菌PCR反應(yīng)的理想退火溫度為55℃,乳桿菌和糞腸球菌PCR反應(yīng)的理想退火溫度為50℃。其擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

表1 5種細(xì)菌的引物序列和擴增片段長度

1.3.6 熒光定量PCR反應(yīng)體系為 20μl其中DNA模板0.5μl,上下游引物（濃度為5 pmol/μl）各1μl,2.5×RealMasterMix和20×SYBR Solution的混合液9 μl,水8.5μl。反應(yīng)程序為:94℃變性4 min后,94℃30 s,50℃（或 55℃）30 s,72℃30 s共40個循環(huán),最后以68℃10min延伸后結(jié)束。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參照文獻[8]的方法,取準(zhǔn)確定量的細(xì)菌菌株作為標(biāo)準(zhǔn)品（為天津市南開醫(yī)院細(xì)菌室保存的質(zhì)控菌株）做系列稀釋后,使其細(xì)菌濃度為105109拷貝/m L,并使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以該DNA為模板進行熒光定量PCR。標(biāo)準(zhǔn)曲線以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標(biāo),以PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)繪制而成。待測樣品的PCR結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較,即可獲得各待測樣品中5種細(xì)菌的具體數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 腹水細(xì)菌培養(yǎng) 模型組大鼠40只,造模72 h后仍存活的有23只,大多數(shù)個體有較多的腹腔滲出液,其性狀為淡黃色或淡粉色混濁半透明液體。假手術(shù)組全部存活,大多數(shù)個體無明顯的腹腔滲出液,收集腹腔灌洗液進行檢測。兩組動物腹水或腹腔灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果見表2。另外,初次厭氧培養(yǎng)出的菌落經(jīng)耐氧試驗篩選后證明全部是需氧菌和兼性厭氧菌,即兩組動物的腹水中沒有專性厭氧菌被檢出。

2.2 PCR產(chǎn)物電泳鑒定 PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示5種細(xì)菌的16SrRNA擴增片段,見圖1。

表2 兩組動物腹水中細(xì)菌檢出率比較（百分率%）

圖1 細(xì)菌16SrRNA擴增片段電泳結(jié)果

2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線生成 以標(biāo)準(zhǔn)菌不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標(biāo),以PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)繪制生成該菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線,圖2為大腸埃希菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 腸道菌群定量 通過熒光定量PCR反應(yīng),將待測樣品的檢測結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較,獲得各樣品中5種細(xì)菌的具體數(shù)量。與假手術(shù)組相比,模型組腸道中雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量明顯減少（P＜0.01）,而大腸埃希菌的數(shù)量則有所增加（P＜0.01）,脆弱類桿菌和糞腸球菌的數(shù)量無明顯變化（P＞0.05）。圖3為大腸埃希菌熒光定量PCR反應(yīng)曲線;兩組動物腸道菌群比較見表3。

圖2 大腸埃希菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 大腸埃希菌的熒光定量PCR反應(yīng)曲線

3 討論

人類胃腸道表面所攜帶正常菌群的重量差不多有1千克,相當(dāng)于最大消化腺-肝臟的重量,它們既參與機體代謝的全過程,又參與許多腸道毒物的分解、消化過程,與宿主健康狀態(tài)休戚相關(guān)。人的一生一般要經(jīng)歷兩次正常微生物群的演替過程,第一次是從出生到第1-2周左右,腸道從無菌到有菌,形成具有嬰幼兒特點的腸道菌群;第二次演替是從乳喂養(yǎng)到混合喂養(yǎng),腸道菌群會發(fā)生大的變動。成人腸道菌群是相對穩(wěn)定的,一般因為患病或是用藥才會發(fā)生變動[9]。人類胃腸道約有300 m2的粘膜表面,種植著上萬種不同種群約1013-1014個細(xì)菌。在胃腸道不同部位,細(xì)菌的定植情況也不相同。胃內(nèi)的正常寄生微生物包括鏈球菌、葡萄球菌、乳桿菌等,由于胃酸的抗微生物作用使得正常的胃內(nèi)的大部分細(xì)菌被殺死,除了幽門螺旋桿菌外,其他的胃細(xì)菌僅僅在胃酸減少的患者中明顯可見。從小腸分離出的微生物種群有乳桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、類桿菌、韋榮氏球菌、葡萄球菌、放線菌屬、酵母菌、白色念珠菌、嗜血菌等。耐酸厭氧型革蘭陽性菌種控制著小腸上端部位,而越靠近遠(yuǎn)端,革蘭陰性菌逐漸增加而占統(tǒng)治地位。大腸中隱匿有超過500種細(xì)菌種群,其中90%以上是專性厭氧菌,主要包括乳桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、丙酸桿菌、優(yōu)桿菌、類桿菌、梭桿菌屬、韋榮氏球菌、葡萄球菌、酵母菌、放線菌、腸桿菌、腸球菌、糞球菌、消化鏈球菌屬等[10]。

本研究發(fā)現(xiàn),模型組動物進行盲腸結(jié)扎穿孔后,其機體依次發(fā)生了不完全性腸梗阻、腸穿孔和腹膜炎等病理改變,其腸道內(nèi)的正常菌群也發(fā)生了相應(yīng)的變化,在正常狀態(tài)下占優(yōu)勢地位的雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌數(shù)量明顯減少,而大腸埃希菌的數(shù)量則有所增加。其中雙歧桿菌和乳桿菌均屬于腸道益生菌,它們參與構(gòu)成腸道的正常防御系統(tǒng)。益生菌在腸道中發(fā)揮重要的生理作用,益生菌通過占據(jù)腸黏膜表面,提高上皮細(xì)胞的防御能力,還可以產(chǎn)生有機酸、游離脂肪酸、氨和過氧化氫,具有降低酸度并抑制或拮抗致病菌的作用。如雙歧桿菌及其表面分子能提高NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性,其代謝產(chǎn)物如小分子酸過氧化氫等活性物質(zhì)形成化學(xué)屏障,阻止致病菌侵入和繁殖,進而提高局部或全身的抗感染能力。目前益生菌在治療醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用面不斷擴大,可以應(yīng)用益生菌進行治療的疾病包括:抗生素相關(guān)性腹瀉（AAD）、腸易激綜合癥（IBS）、炎癥性腸?。↖BD）、幽門螺桿菌感染、各種便秘、結(jié)腸癌和高膽固醇血癥等[11]。

另一方面,在本研究中動物腹水細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示:模型組大腸埃希菌的檢出率達到100%,說明大腸埃希菌是該模型大鼠主要的致病菌或致死菌。而鏈球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、摩根氏菌和微球菌等檢出率也高于假手術(shù)組,上述細(xì)菌多數(shù)屬于條件致病菌,在正常的腸道中也是存在的,但數(shù)量有限并且與益生菌之間保持平衡狀態(tài),當(dāng)機體發(fā)生腸梗阻、腸穿孔、腹膜炎和膿毒癥時這種平衡被打破,條件致病菌則會在腸道、腹腔甚至在血液中大量繁殖,進而引起MODS甚至死亡等嚴(yán)重后果。

綜上所述,本研究在膿毒癥大鼠模型研究的基礎(chǔ)上,進一步對其腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)進行分析,發(fā)現(xiàn)了膿毒癥大鼠與正常大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化,找出了導(dǎo)致膿毒癥大鼠患病甚至引起死亡的主要致病菌群。從一個新的角度解釋了膿毒癥的病理過程,也同時為達成有效降低膿毒癥死亡率這一全球的共同目標(biāo)提供理論依據(jù)。

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