雌二醇可降解涂層支架置入后對(duì)犬冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增生的影響

宋春莉,張基昌,李楊雪,劉 斌,崔曉倩,李智博,史永峰

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130041）

冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后再狹窄一直是冠心病介入治療研究中的重中之重,其中以冠脈內(nèi)支架涂層的研究尤為突出。目前應(yīng)用的藥物涂層支架如雷帕霉素與紫杉醇涂層支架,在阻止平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞增生,使支架被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或難以被覆蓋,容易形成血栓[1,2]。通過(guò)加速內(nèi)皮化已被證實(shí)可降低再狹窄及支架內(nèi)血栓形成,是最具前景的研究方向[3]。雌激素具有復(fù)雜多樣的生理作用,體外研究已證實(shí)雌激素能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,而作用于內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)則可促進(jìn)其增殖和遷移[8]。根據(jù)此特點(diǎn),本研究通過(guò)構(gòu)建載雌激素可降解涂層支架,期望加速受損內(nèi)膜修復(fù)的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)消除再狹窄,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其安全性及有效性,為新型血管支架的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雜種犬15條（由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）,重20-25 kg。隨機(jī)分為3組,雌二醇涂層支架組,聚乳酸（PLA）涂層支架組,裸支架組,每組5只。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 316L不銹鋼裸支架（購(gòu)自樂(lè)普醫(yī)療器械股份有限公司）;聚乳酸（中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所提供）;氯吡格雷（波立維,賽諾非公司）;HE染色劑;17-β雌二醇（購(gòu)自sigma公司）;枸橡酸鈉;甲醛等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 采用共混的方法制備雌二醇涂層支架。術(shù)前1日給予阿司匹林100 mg,氯吡格雷75mg,術(shù)晨禁食。動(dòng)物麻醉采用速眠新,肌肉注射0.1 ml/kg,術(shù)中適當(dāng)追加,總量＜0.2 ml/kg。支架用手捏方法捆綁于球囊上,行冠狀動(dòng)脈造影,隨機(jī)選擇左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈的合適血管段,定量冠狀動(dòng)脈造影（QCA）測(cè)定其直徑,根據(jù)參考血管直徑,用帶支架球囊以球囊/血管1.3∶1的比例,用10-15大氣壓、15 s單次過(guò)度擴(kuò)張血管形成冠狀動(dòng)脈損傷模型并置入裸支架或PLA涂層支架或雌二醇涂層支架,術(shù)后常規(guī)復(fù)查冠狀動(dòng)脈造影示血管通暢。術(shù)后撤出動(dòng)脈鞘,穿刺點(diǎn)縫合,逐層縫合皮膚,送回動(dòng)物房喂養(yǎng)。術(shù)后予以青霉素300萬(wàn)單位,繼續(xù)給予口服氯吡格雷37.5mg/d,拜阿司匹林100 mg/d,飼養(yǎng)到4周。

1.3 組織標(biāo)本制備 支架置入術(shù)后4周對(duì)實(shí)驗(yàn)犬實(shí)施處死.立刻分離靶血管,至少1 cm,包括支架置入部位的遠(yuǎn)端及近端,10%甲醛溶液加壓灌注固定24小時(shí),固定后環(huán)氧樹(shù)脂包埋切片,4-5μm厚切片,HE染色及彈力染色。

1.4 病理形態(tài)學(xué)分析 由計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)分別測(cè)定內(nèi)膜增生面積、管腔橫斷面積。內(nèi)膜增生面積為原始管腔和狹窄管腔面積之差（原始管腔面積-狹窄管腔面積）,面積狹窄百分比由下列公式計(jì)算:面積狹窄百分比=100×[1-（狹窄管腔面積÷原始管腔面積）]。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 所有動(dòng)物支架均成功置入并存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

2.2 涂層支架一般性狀 光學(xué)顯微鏡觀(guān)察涂層支架擴(kuò)展時(shí)的順應(yīng)性,支架直徑達(dá)到4mm時(shí),涂層無(wú)明顯裂開(kāi)、剝脫現(xiàn)象。

2.3 組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果 造影結(jié)果顯示即刻植入后的支架血管比率、平均血管直徑,三組比較無(wú)明顯差別。支架置入4周后的狀況（表1及圖1）:三組管腔面積,雌二醇支架組最大,PLA組及裸支架組無(wú)明顯差異。雌二醇支架組內(nèi)膜增生面積較裸支架組及PLA涂層支架組減低（P＜0.05）,PLA涂層支架組和裸支架組無(wú)明顯差別（P均＞0.05）。說(shuō)明雌二醇支架加速內(nèi)膜修復(fù),可減少內(nèi)膜過(guò)度增生。

表1 支架置入4 w后各組組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s）組別 例數(shù) 內(nèi)膜增生面積（IA） 管腔總面積（TA） 面積狹窄百分比（%）雌二醇支架組 5 0.37±0.16* 4.91±0.38* 7.2±1.6*PLA涂層支架組 5 1.41±0.31# 3.90±0.43# 26.2±2.0#裸支架組 5 1.36±0.25# 3.98±0.61# 25.2±3.4#注:與PLA涂層支架組和裸支架組相比:*＜0.05;PLA涂層支架組與裸支架相比:#＞0.05

圖1 4 w后冠狀動(dòng)脈橫斷面（HE染色,10×）

3 討論

冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后再狹窄一直是冠心病介入治療研究熱點(diǎn)。目前應(yīng)用的藥物涂層支架如雷帕霉素與紫杉醇涂層支架,大大減少了再狹窄的發(fā)生率,但目前仍有5%左右再狹窄發(fā)生[3]。雷帕霉素與紫杉醇都是非平滑肌細(xì)胞選擇性藥物,在阻止平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞增生,使支架被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或難以被覆蓋,容易形成血栓。此外,在支架置入動(dòng)脈部分可觀(guān)察到不同程度的慢性炎癥從而刺激內(nèi)膜增生導(dǎo)致再狹窄[4]。2006年歐洲心血管年會(huì)引起會(huì)議巨大震動(dòng)和關(guān)注的內(nèi)容是關(guān)于藥物洗脫支架安全性的臨床試驗(yàn)薈萃分析。長(zhǎng)期隨訪(fǎng)結(jié)果表明,與金屬裸支架比較,藥物涂層支架置入后遠(yuǎn)期血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)比金屬裸支架增加了15%-35%,不但沒(méi)有降低總死亡率和心肌梗死的預(yù)后硬終點(diǎn),反而有增加這些預(yù)后終點(diǎn)的趨勢(shì)[3-5]。相關(guān)檢查發(fā)現(xiàn),其遠(yuǎn)期血栓發(fā)生率增高的主要原因?yàn)橹Ъ鼙砻鎯?nèi)皮化不完全,部分支架裸露在血液中,而患者停用抗血小板藥物,使支架內(nèi)血栓發(fā)生率明顯增高[4]。故由于存在上述缺點(diǎn),導(dǎo)致冠脈內(nèi)支架置入術(shù)后患者服用雙重或三重抗血小板藥物時(shí)間增長(zhǎng),從而增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用,增加了患者長(zhǎng)期雙重抗血小板治療出血風(fēng)險(xiǎn)。而且長(zhǎng)期內(nèi)皮修復(fù)不完全,會(huì)刺激內(nèi)膜增生導(dǎo)致再狹窄。故由于存在上述缺點(diǎn),如何加速受損內(nèi)膜修復(fù)的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)防治再狹窄這一目的,是一嶄新且極具前景的研究方向。

隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的深入,目前普遍認(rèn)為內(nèi)皮損傷引起的瀑布反應(yīng)是再狹窄的始動(dòng)因素[6,7]。因此在抑制平滑肌增殖的同時(shí),加速內(nèi)皮損傷的修復(fù)更重要。同時(shí)加速內(nèi)皮修復(fù)受損內(nèi)膜可降低支架暴露于血液中時(shí)間,降低支架置入術(shù)后遠(yuǎn)期血栓發(fā)生率,減少患者長(zhǎng)期多重抗血小板治療的時(shí)間。最近的研究報(bào)道更新了我們對(duì)血管新生內(nèi)膜形成的理解,血管新生內(nèi)膜不僅可以從血管壁形成還可以由血液循環(huán)中前體細(xì)胞群形成,例如內(nèi)皮前體細(xì)胞[7]。

內(nèi)皮化的速度是影響內(nèi)膜增生程度的一個(gè)重要因素。雌激素體外研究已證實(shí)雌激素能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,而作用于內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)則可促進(jìn)其增殖和遷移[8,15]。研究證實(shí)雌激素可促進(jìn)兔髂動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)皮細(xì)胞增殖,加快內(nèi)皮修復(fù)并提高損傷內(nèi)皮功能[11]。Krasinski[9]等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素能促進(jìn)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷區(qū)的再內(nèi)皮化和內(nèi)皮細(xì)胞功能的恢復(fù)。Strehlow[10]等發(fā)現(xiàn)雌激素能夠提高小鼠骨髓及外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞在損傷動(dòng)脈處著床、生長(zhǎng),從而促使損傷血管內(nèi)皮化。機(jī)械損傷是導(dǎo)致PCI術(shù)后血管平滑肌細(xì)胞大量增殖、遷移及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要原因。據(jù)報(bào)道血管損傷早期,雌激素能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO、加速損傷血管的再內(nèi)皮化;同時(shí),雌激素還可抑制損傷局部的炎癥反應(yīng)及損傷后血管平滑肌細(xì)胞絲裂素活化蛋白激酶的激活,通過(guò)這些途徑起到抑制新生內(nèi)膜形成的作用[11-13]。上述研究初步證實(shí)17β-雌二醇洗脫支架安全、有效,具有良好的潛在臨床應(yīng)用前景。

前期New[14]等采用磷酸膽堿包被支架攜帶17β雌二醇植入豬冠狀動(dòng)脈,4周時(shí)17β雌二醇洗脫支架組較裸金屬支架組降低了40%的內(nèi)膜增生。與new實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,我們利用可降解高分子PLA作為載體,構(gòu)建了生物可降解雌二醇洗脫支架,實(shí)驗(yàn)中雌二醇支架組內(nèi)膜增生面積比較裸支架組及PLA支架組減低,而裸支架組與PLA支架組無(wú)顯著差異,說(shuō)明聚乳酸作為可降解載體具有良好的生物相容性,并沒(méi)有增加內(nèi)膜增生,同時(shí)具有可降解功能,提高了支架的安全性。因?yàn)橥ㄟ^(guò)正常的機(jī)體代謝途徑,經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間,聚合物最終降解成小分子物質(zhì)排出體外,沒(méi)有殘留,消除了潛在的聚合物對(duì)血管的不良反應(yīng)可滿(mǎn)足支架載體要求。說(shuō)明生物可降解高分子載雌二醇洗脫支架可通過(guò)加速內(nèi)皮化,可減少內(nèi)膜過(guò)度增生,防止再狹窄,為將來(lái)解決支架內(nèi)再狹窄提供新的理念和方法。

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