不同培養(yǎng)條件下對(duì)阿薩希毛孢子菌生物被膜影響的研究

樊 昕,任曉萍,李海濤,楊蓉婭

（北京軍區(qū)總醫(yī)院·全軍皮膚病診治中心,北京 100125）

近年來(lái),由生物被膜引起的微生物耐藥明顯增加,有學(xué)者認(rèn)為大于80%的人類感染中有生物被膜的形成[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多因素可以影響真菌生物被膜的形成,如物理性質(zhì):基質(zhì),碳源,唾液的存在,氧氣的存在,表面限定,酸堿環(huán)境;環(huán)境因素:熱,冷,紫外線;真菌的種類等[2]。本實(shí)驗(yàn)以不同培養(yǎng)條件下,如不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值觀察其對(duì)T.asahii BF形成的影響,為臨床研究真菌生物被膜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 阿薩希毛孢子菌株1株,為本院皮膚科臨床分離株（BZP07002）,并經(jīng)API20AUX生化鑒定及DNA序列分析驗(yàn)證（AS2.2174）[3];RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,XTT試劑購(gòu)自美國(guó)AppliChem公司,PMS購(gòu)自Sigma公司,倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司,全自動(dòng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜體外構(gòu)建 將-80℃保存的阿薩希毛孢子菌菌種復(fù)蘇,在沙氏培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)種培養(yǎng)2次,轉(zhuǎn)入酵母蛋白胨葡萄糖肉湯（YPD）中過(guò)夜振蕩培養(yǎng),離心、收集后,重懸于 RPMI-1640中,稀釋成106CFU/ml菌懸液。在培養(yǎng)板中預(yù)先放入無(wú)菌的聚苯乙烯（長(zhǎng)寬各為1.0 cm）。將2m l該菌懸液加入到24孔培養(yǎng)板中,選擇30℃培養(yǎng) 48-72 h。2 h時(shí)PBS緩沖液沖洗2次,重新加入2.0m lRPMI-1640培養(yǎng)液。之后每隔24 h更換一次培養(yǎng)液。設(shè)不加有阿薩希毛孢子菌的空白對(duì)照組。

1.2.2 生物被膜形成的定量分析 通過(guò)XTT還原比色測(cè)定法進(jìn)行定量分析。測(cè)定依據(jù)通過(guò)代謝活性細(xì)胞使黃色的四唑鹽XTT分裂成橘黃色的甲染料。RPM I1640培養(yǎng)液中加入XTT和電子耦合劑PMS使終濃度為12.5μmol/L。在預(yù)先洗滌培養(yǎng)的生物膜孔和空白對(duì)照孔中放入1.5 ml的XTT-PMS溶液,30℃避光培養(yǎng)2 h。離心上清液平分在96孔板中,微量滴定板492 nm下讀數(shù)。同時(shí)將含有生物被膜的聚苯乙烯材料放入YPD液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)48 h,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)評(píng)估總的活菌數(shù)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察 將已構(gòu)建生物被膜的聚苯乙烯用滅菌的PBS緩沖液沖洗2次,放置在載玻片上倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 不同pH值培養(yǎng)基和吸光度檢測(cè) 取菌懸液50μl加入含有不同pH培養(yǎng)基150μl/孔的96孔板,分3組不同pH:pH=5.0,pH=5.0-7.0（前24 h培養(yǎng)基ph=7.0,后48 h培養(yǎng)基ph=5.0）,pH=7.0培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每組做3個(gè)平行孔,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),以不含菌懸液的孔作為基線對(duì)照;48-72 h取出相應(yīng)的96孔板。吸出孔內(nèi)菌懸液,PBS清洗孔3次去除浮游菌,微孔板在室溫下干燥30min;加入1%Crystal Violet200μl/孔染色,放置20min后吸出染液,PBS清洗孔3次去除孔壁染液,微孔板在室溫下干燥30min;加入95%乙醇200μl/孔微量振蕩器上震蕩30min復(fù)吸染液,復(fù)吸液放入一新的96孔微孔板中;全自動(dòng)酶聯(lián)免疫儀測(cè)定630 nm處的吸光（OD）值,并繪制曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)）和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較。取α=0.01為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)溫度下生物被膜的形成

以T.asahii聚苯乙烯表面形成生物被膜48 h為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)觀察其20℃,25℃,30℃,35℃和40℃不同溫度下生物膜形成的差異性。其隨著溫度不斷升高,其生物被膜形成速度加快,但是超過(guò)40℃時(shí)穩(wěn)定性逐漸降低。見(jiàn)表1,圖1。

表1 不同培養(yǎng)溫度下阿薩希毛孢子菌生物被膜的定量XTT測(cè)定（±s±s）和活菌計(jì)數(shù)溫度 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃XTT值 0.131±0.012 0.984±0.045 1.312±0.101 1.105±0.101 0.793±0.019活菌數(shù) 1.73×106 7.86×106 10.23×106 8.92×106 6.16×106

圖1 不同培養(yǎng)溫度下阿薩希毛孢子菌生物被膜的定量XTT測(cè)定和活菌計(jì)數(shù)

2.2 不同pH培養(yǎng)基下生物被膜的形成

用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀630 nm可見(jiàn)光測(cè)定阿薩希毛孢子菌生物被膜OD值時(shí)發(fā)現(xiàn),在體外pH=5.0時(shí)和pH=9.0不能形成生物被膜;pH=7.0時(shí)生物被膜形成表現(xiàn)為緩慢的非線性生長(zhǎng),24-48 h生物被膜開(kāi)始成熟,48 h-56 h間出現(xiàn)一相對(duì)的生長(zhǎng)停滯期,此后OD值下降,生物被膜老化,pH=5.0對(duì)已經(jīng)形成24 h的阿薩希毛孢子菌生物膜生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,但經(jīng)歷12 h的酸休克后生物被膜 均能恢復(fù)生長(zhǎng)。見(jiàn)表2,圖2,3。

表2 不同pH培養(yǎng)條件下阿薩希毛孢子菌生物膜的定量XTT測(cè)定（±s±s）和活菌計(jì)數(shù)pH值 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 XTT值 0.053±0.005 0.559±0.037 1.439±0.123 0.417±0.037 0.033±0.002活菌數(shù) 0.73×106 5.89×106 11.48×106 3.98×106 0.51×106

圖2 不同pH培養(yǎng)條件下阿薩希毛孢子菌生物膜的定量XTT測(cè)定和活菌計(jì)數(shù)

圖3 不同pH培養(yǎng)條件下阿薩希毛孢子菌生物膜形成情況

3 討論

播散性毛孢子菌病呈世界性分布,是一種慢性、頑固、難治的系統(tǒng)性真菌病,其發(fā)病呈逐年上升的趨勢(shì)[4],T.asahii是引起該病的重要致病菌。近年來(lái)各種醫(yī)用材料（各種支架、導(dǎo)管、瓣膜、起搏器、人工關(guān)節(jié)等材料）的使用率很高,而微生物易于粘附于其表面且可形成生物被膜,導(dǎo)致耐藥性增加而感染灶不易清除[5]。相對(duì)于其懸浮狀態(tài)而言,被膜內(nèi)菌細(xì)胞的形態(tài)常與浮游菌不同,且對(duì)藥物的敏感性差[6]。我們發(fā)現(xiàn)真菌耐藥現(xiàn)象越來(lái)越普遍,主要由于近年來(lái)抗真菌藥物品種和臨床使用量的增多,以及藥物的選擇性壓力,特別是一些侵入性治療如體外插管等操作致使耐藥真菌數(shù)量及種類迅速增加,不僅影響藥物的治療效果,而且呈現(xiàn)出交叉耐藥[7]。

既往我們的研究表明[8]:阿薩希毛孢子菌可以形成生物被膜,包括真菌表面粘附,微菌落形成,生物被膜成熟,生物被膜中阿薩希毛孢子菌的活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加,當(dāng)生長(zhǎng)趨于成熟時(shí),代謝的活性相對(duì)穩(wěn)定,但仍保持在一個(gè)高水平。進(jìn)一步研究我們發(fā)現(xiàn)[9]:成熟期T.asahii BF不同層面的活菌數(shù)和活性差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,生物被膜中存在孔隙結(jié)構(gòu),活菌圍繞在孔隙周圍并被死菌包裹,使活菌一方面可直接從孔隙中獲得營(yíng)養(yǎng),又可抵御環(huán)境中有害物質(zhì)的破壞。但是不同的培養(yǎng)條件是否會(huì)影響生物被膜的形成,其主要變化趨勢(shì)是什么,對(duì)于阿薩希毛孢子菌形成生物被膜的最佳培養(yǎng)條件是什么?

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn):不同培養(yǎng)溫度會(huì)明顯影響生物被膜的形成。在聚苯乙烯表面形成生物膜48 h為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)觀察其20℃,25℃,30℃,35℃和40℃不同溫度下生物膜形成,其隨著溫度不斷升高,其生物膜形成速度加快,但是超過(guò)40℃時(shí)穩(wěn)定性逐漸降低,但是相對(duì)于浮游狀態(tài)其對(duì)溫度的耐受性更高。分析其生物膜形成主要是依靠真菌本身增殖情況和在合適的條件下才能聚集、黏附和逐漸形成生物膜,但是較低溫度時(shí)真菌活性較低,增殖較慢無(wú)法形成生物被膜結(jié)構(gòu);但是在較高溫度雖然真菌活性較高但是由于活菌量增多與死菌量增多不成比例導(dǎo)致菌體間黏附性明顯改變,其表現(xiàn)為穩(wěn)定性降低,其形成的生物被膜穩(wěn)定性相應(yīng)降低最終導(dǎo)致生物被膜活性降低等一系列變化[2]。我們認(rèn)為30-35℃是 T.asahii BF形成的合適溫度,這也是大部分真菌培養(yǎng)的合適溫度。

本研究發(fā)現(xiàn)不同pH條件下生物被膜生長(zhǎng)變化較大,在體外過(guò)酸pH=5.0或者過(guò)堿pH=9.0時(shí)不能形成生物被膜,分析其主要是有在這種條件下真菌活性明顯受到影響,活力下降甚至死亡而不能生成生物被膜。我們的研究結(jié)果表明pH=7.0條件下生物被膜形成表現(xiàn)為緩慢的非線性生長(zhǎng),6 h生物被膜已經(jīng)形成,12-24 h生物被膜成熟,24-36 h出現(xiàn)一相對(duì)的生長(zhǎng)停滯期,此后由于生物被膜中死菌比例增加,易于脫落的死菌在檢測(cè)前被洗滌棄去,提示生物被膜處于老化階段。pH=5.0時(shí)菌株不能形成生物被膜,但已經(jīng)成膜12h的生物膜卻可耐受pH=5.0酸的影響,雖然酸對(duì)生物被膜生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,但是經(jīng)歷12 h的酸休克后菌株的生物被膜均能在低pH條件下（pH=5.0）恢復(fù)生長(zhǎng)。該現(xiàn)象證實(shí)生物被膜狀態(tài)的阿薩希毛孢子菌具有更強(qiáng)的抗酸能力,能在較低pH條件下代謝生存,這可能與生物被膜特有的結(jié)構(gòu)有關(guān):生物被膜是由胞外基質(zhì)包裹的相互黏附的真菌性群體組成的三維結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)是生物膜真菌的保護(hù)裝置,可有效抵御酸性的滲透[10]。在這種狀態(tài)下,酸只能對(duì)表層真菌有影響,而無(wú)法對(duì)深層真菌發(fā)揮作用。其次生物膜中營(yíng)養(yǎng)成分的濃度由外向內(nèi)呈現(xiàn)梯度下降,致使深層真菌長(zhǎng)期處于營(yíng)養(yǎng)缺失狀態(tài)而生長(zhǎng)緩慢。生物膜深層真菌所處的這種緩慢生長(zhǎng)狀態(tài),也稱為饑餓狀態(tài),處于該狀態(tài)的真菌對(duì)酸性的敏感性降低,這可能是生物被膜耐酸的另外一個(gè)原因。

總之,通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)30-35℃,培養(yǎng)基pH=7.0時(shí) T.asahii BF的形成能力最強(qiáng),但是其溫度的影響機(jī)制特別是在酸性環(huán)境中能夠恢復(fù)一定程度生長(zhǎng)的具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究,這也是我們今后研究的方向和主要內(nèi)容。

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