固定化脂防酶在非水相合成中的應(yīng)用

孫月娥，王衛(wèi)東(徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州221008)

固定化脂防酶在非水相合成中的應(yīng)用

孫月娥，王衛(wèi)東*(徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇徐州221008)

脂肪酶是分解脂肪的酶，非水體系可促使反應(yīng)平衡逆向進行，因而脂肪酶又具有合成功能。目前非水相脂肪酶催化合成技術(shù)在食品、醫(yī)藥、化妝品等多個領(lǐng)域中都有廣泛的應(yīng)用。本文對非水相中脂肪酶的反應(yīng)體系、影響非水相酶促反應(yīng)的因素以及其應(yīng)用領(lǐng)域進行了綜述，對于深入研究非水體系中脂肪酶催化的合成反應(yīng)具有較強的參考價值。

脂肪酶，非水相，合成

脂肪酶具有多種催化能力，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、酯交換及酯類的逆向合成反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)［1－2］。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點和催化活力，脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系，在油水界面促進酯水解，而非水體系可以使反應(yīng)熱力學(xué)平衡從水解反應(yīng)轉(zhuǎn)為其逆反應(yīng)，因而在有機相中可以促進酯合成和酯交換［3－4］。目前非水相脂肪酶催化合成技術(shù)在食品及相關(guān)領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用，其中用于有機相合成的具有轉(zhuǎn)酯化或酯化功能的脂肪酶催化的生物合成代表了未來產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。

1 非水相酶學(xué)概況

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為酶只能在水溶液中發(fā)揮催化作用，但自從1986年Klibanov發(fā)現(xiàn)許多酶能在接近無水的有機溶劑中進行有效催化以來，非水相酶學(xué)研究取得了長足發(fā)展，酶學(xué)領(lǐng)域誕生了一個全新的學(xué)科方向——非水酶學(xué)。

1.1 酶在非水介質(zhì)中的特性

有機相中酶促反應(yīng)，除了具有水相中酶的催化優(yōu)點外，還具有以下特點:可以催化水相中很難進行的疏水性物質(zhì)的反應(yīng);酶的熱穩(wěn)定性顯著提高;抑制有水參與的副反應(yīng)(如酯水解)，可使某些反應(yīng)的熱力學(xué)平衡向合成方向移動，如酯合成、酯交換等;產(chǎn)物從低沸點的溶劑中分離純化比從水中容易;酶不溶于有機溶劑，容易回收再利用;沒有微生物的污染;可以控制底物專一性等。

1.2 酶的固定化

游離脂肪酶在有機溶劑中不溶解，反應(yīng)過程中容易結(jié)塊，使用后不易回收重復(fù)利用，產(chǎn)物也不易分離，實際應(yīng)用中常對酶進行化學(xué)修飾或固定化。雖然酶固定化后，其催化作用由均相轉(zhuǎn)移到異相，由此帶來的擴散限制效應(yīng)、空間障礙、載體性質(zhì)等因素對酶的性質(zhì)產(chǎn)生影響，但是固定化酶與游離酶相比，具有很多優(yōu)點:可以擴大酶與底物的接觸面積，提高酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性，可以調(diào)節(jié)和控制酶的活性和選擇性，有利于將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開，可以重復(fù)利用和裝柱連續(xù)化生產(chǎn)，促進脂肪酶催化技術(shù)的工業(yè)化。

2 非水相酶催化的反應(yīng)體系

2.1 水－有機溶劑兩相體系

酶溶解于水相，底物和產(chǎn)物溶解于有機相，酶與有機溶劑在空間上的分離，使酶處在有利的水環(huán)境中，而不直接與有機溶劑相接觸。水－有機溶劑兩相體系已成功地用于強疏水性底物如甾體、脂類和烯烴類的生物轉(zhuǎn)化［5］。

2.2 微水有機溶劑單相體系

分為水不互溶有機溶劑單相體系和水互溶有機溶劑單相體系。前者是用與水不互溶的有機溶劑取代所有的溶劑水(>98%)，形成固相酶分散在有機溶劑中的單相體系，酶表面殘余的結(jié)構(gòu)水，可以保證酶的催化活性。該體系中，溶劑容易奪取酶維持構(gòu)象所必需的水，導(dǎo)致酶失去活性。水互溶有機溶劑單相體系是由與水互溶的有機溶劑組成，酶、底物、產(chǎn)物均能溶解于該體系中，主要用于親脂性底物的生物轉(zhuǎn)化。

2.3 反膠束體系

是表面活性劑與少量水存在的有機溶劑體系。水分子聚集在反相膠束內(nèi)核中形成“小水池”，可增溶蛋白質(zhì)和酶，酶被限制在含水的微環(huán)境中，而底物和產(chǎn)物可以自由進出膠束。由于反膠束體系能夠較好地模擬酶的天然環(huán)境，因而在反膠束體系中，大多數(shù)酶能夠保持催化活性和穩(wěn)定性，甚至表現(xiàn)出“超活性”(superactivity)［6］。

2.4 超臨界流體體系

二氧化碳、烷烴類(甲烷、乙烯、丙烷)等超臨界氣體在臨界點附近的溫度或壓力有一點微小的變化都會導(dǎo)致底物和產(chǎn)物溶解度的極大變化，因而很容易調(diào)控超臨界氣體中酶催化反應(yīng)的特性。Palocci等［7］對三苯甲基吡喃葡萄糖苷在超臨界二氧化碳中合成進行了研究。與有機溶劑相比，底物的溶解性更好，溶劑回收徹底，可以獲得高純度產(chǎn)物。該體系的缺點是需要高壓容器，并且減壓時易使酶失活。

2.5 固相合成

是直接以底物作為反應(yīng)介質(zhì)的完全不用溶劑的無溶劑酶催化反應(yīng)體系，由于沒有溶劑的稀釋作用，提高了反應(yīng)底物濃度，反應(yīng)速度快，產(chǎn)物收率高，后處理簡單，環(huán)境污染小，是一種極具潛力的清潔反應(yīng)新技術(shù)［8］。

2.6 離子液體

是由有機陽離子和無機或有機陰離子構(gòu)成的低熔點鹽類，具有可忽略的蒸汽壓力、不揮發(fā)性、高(熱、化學(xué))穩(wěn)定性及對環(huán)境友好等特性。另外，離子液體的極性、疏水性、粘度及溶解性均可通過其陽離子和陰離子的適當(dāng)修飾來調(diào)節(jié)。Adamczak等［9］對離子液體中油酸抗壞血酸酯的合成條件進行了優(yōu)化。離子液體可提高酯化反應(yīng)的選擇性，但離子液體的粘度高于有機溶劑，影響底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)速度，也增大了反應(yīng)液過濾和酶分散的難度。

3 影響非水相中脂肪酶催化活性的因素

3.1 脂肪酶

脂肪酶是一類特殊的酰基水解酶，具有對油－水界面的親和力，并在界面上表現(xiàn)最大活力。不同來源的脂肪酶在結(jié)構(gòu)上具有明顯的差異，在催化不同底物時的活性相差很大，即使來源相同但固定化方法不同都會導(dǎo)致脂肪酶活力的差異，恰當(dāng)?shù)剡x擇脂肪酶的種類對催化反應(yīng)的效率至關(guān)重要。

3.2 水分活度

由于不同體系中水與底物、介質(zhì)的作用不同，相同的含水量所起的作用未必相同，因此一般用水分活度來更真實地反映體系中水和其他組分之間的關(guān)系。水分活度是影響酶催化反應(yīng)活性和反應(yīng)平衡的最大因素，在絕對無水體系中的酶不表現(xiàn)催化活性［10］。

3.3 反應(yīng)介質(zhì)

水溶性和非水溶性的有機溶劑均可作為酶促合成的反應(yīng)介質(zhì)，但不同溶劑對酶和酯化反應(yīng)速度有不同的影響。丙酮、乙腈和叔丁醇等水溶性有機溶劑有利于糖等親水性底物的溶解，但它們可能攝取酶分子中保持其催化活性所必需的水，從而降低酶的活性，甚至使其失活［11］。己烷和異辛烷等疏水的非極性溶劑有助于保持酶的催化活性，但不利于糖的溶解，合成反應(yīng)速度極其緩慢［12］。此外，溶劑的極性對產(chǎn)物的平衡轉(zhuǎn)化率也有一定的影響。因此，有機溶劑的選擇要綜合考慮如下因素:對酶活的影響、底物和產(chǎn)物的溶解性、揮發(fā)性、毒性及反應(yīng)后處理等。

3.4 底物

Xiao等［13］報道在叔丁醇和嘧啶的混合溶劑中用NOV 435催化合成蔗糖酯時，初始酯化速度和糖酯的產(chǎn)率隨著脂肪酸鏈長的縮短而上升。由于只有溶解于溶劑的糖才能有效地參與酯化反應(yīng)，而不同的糖在有機溶劑中的溶解度不同，因此糖也可對合成糖酯的酯化反應(yīng)速度產(chǎn)生重要影響。此外，底物的摩爾比和濃度也對酶促反應(yīng)產(chǎn)生影響，底物摩爾比影響反應(yīng)平衡，而底物的濃度則直接影響到酶的催化活性，因此確定合適的底物摩爾比和濃度十分重要［14］。

3.5 反應(yīng)溫度和時間

反應(yīng)溫度是影響化學(xué)平衡常數(shù)的重要參數(shù)，溫度不但影響酶的熱穩(wěn)定性和催化活性，也影響底物的狀態(tài)以及產(chǎn)物的傳質(zhì)速度。提高反應(yīng)溫度可提高底物的溶解度，降低溶液的粘度，加快傳質(zhì)過程，促進底物與酶的有效接觸，加快化學(xué)反應(yīng)的速度［15］，但高溫會加速酶活損失。為了得到盡可能多的產(chǎn)物，延長反應(yīng)時間是最為簡便經(jīng)濟的方法。然而當(dāng)反應(yīng)進行到一定時間時，轉(zhuǎn)化率趨于恒定，此時單純的延長反應(yīng)時間只能是增加生產(chǎn)成本。

除了上述因素外，還有許多因素影響酶催化效率，例如，搖床振蕩速度關(guān)系到外擴散限制，加酶量關(guān)系到反應(yīng)的經(jīng)濟性等。

4 非水相脂肪酶催化技術(shù)的應(yīng)用

非水相酶學(xué)的發(fā)展極大地促進了酶在有機合成中的應(yīng)用。據(jù)報道，已有包括脂肪酶、蛋白酶等在內(nèi)的十多種酶用于有機溶劑中的催化反應(yīng)，但研究最多的還是脂肪酶。

4.1 合成表面活性劑

目前在非水介質(zhì)中利用固定化脂肪酶催化技術(shù)已成功地合成了葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、麥芽糖和蔗糖等的脂肪酸糖酯［15－17］，非水相酶法合成技術(shù)得到了長足發(fā)展。日本及德國在90年代開發(fā)的酶法生產(chǎn)單甘酯新工藝，目前已實現(xiàn)了規(guī)模生產(chǎn)。

4.2 合成營養(yǎng)強化劑

多不飽和脂肪酸(PUFA)具有防治心腦血管疾病、降低糖尿病、高血壓和癌癥發(fā)病率、增加免疫力等許多生理功能，但長鏈PUFA的吸收有一定困難，利用非水相脂肪酶催化合成PUFA的酯，促進PUFA的吸收具有應(yīng)用意義。Cardan等［18］在固定化脂肪酶的作用下，合成了富含PUFA的鱈魚肝油甘三酯。Akimoto等［19］對大豆油與沙丁魚中PUFA濃縮物之間的酯交換反應(yīng)進行了研究。

4.3 生產(chǎn)人造奶油和類可可脂

脂肪酶可在相對溫和的條件下催化油脂間的轉(zhuǎn)酯或酯交換，增加油脂中飽和脂肪酸的量，從而獲得質(zhì)量較好的人造奶油。脂肪酶催化油脂間酯交換生產(chǎn)可可脂亦被人們廣泛關(guān)注，Wang等利用固定化脂肪酶催化茶籽油、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯間的酯交換反應(yīng)制備了可可油類似物［20］。

4.4 生物柴油

生物柴油是一類以天然植物油為原料制成的脂肪酸單酯，具有環(huán)保清潔、可再生、安全性好等優(yōu)點，是一種真正的綠色能源，可完全替代礦物油作為燃料［21］。用生物酶催化法合成生物柴油具有條件溫和、醇用量小、無污染物排放;副產(chǎn)品甘油的回收較易，操作方便;反應(yīng)物中的游離脂肪酸能完全轉(zhuǎn)化成酯等優(yōu)點。

4.5 合成天然風(fēng)味物質(zhì)

固定化脂肪酶也被用于芳香酯的合成。乙酸乙酯、丁酸異戊酯、安息香甲酯等低分子量芳香酯多呈天然水果香味，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。Krishna等利用固定化脂肪酶催化合成了乙酸異戊酯［22］。

4.6 生產(chǎn)護膚產(chǎn)品

維生素A及其衍生物在化妝品及制藥學(xué)如護膚產(chǎn)品極具商業(yè)潛力，還是重要的添加劑，廣泛用于食品、飼料的營養(yǎng)強化。但VA非常不穩(wěn)定，通過在有機溶劑中用脂肪酶催化VA產(chǎn)生視黃醇酯，可增大其穩(wěn)定性［23］?？箟难崾菓?yīng)用廣泛的天然抗氧化劑，但是它的高度水溶性限制了它在化妝品或油脂中的應(yīng)用，近年來許多學(xué)者通過固定化脂肪酶對其進行酯化，從而改變它在油基產(chǎn)品中的溶解性［24］。

5 結(jié)語

自從非水酶學(xué)誕生以來，固定化脂肪酶在非水相合成中的應(yīng)用已有很多報道，目前已有工業(yè)化的吐溫系列、司盤系列以及單甘酯系列的表面活性劑上市，并在食品、醫(yī)藥、化工等產(chǎn)品中得到廣泛的應(yīng)用。近年來在非水介質(zhì)中利用脂肪酶合成脂肪酸糖酯成為研究熱點，并已有工業(yè)化的蔗糖酯系列產(chǎn)品投入使用。除了飽和脂肪酸因其穩(wěn)定性好成為最常采用的原料外，不飽和脂肪酸的功能特性以及一些特殊的使用性質(zhì)使其成為新的研究焦點。在市售的商品中，司盤80和吐溫80就是山梨糖醇(衍生物)的單油酸酯，在食品中可用作乳化劑;油酸單甘酯是性能優(yōu)異的賦脂劑，已經(jīng)用于護膚品、護發(fā)品、沐浴露等產(chǎn)品中;生物柴油的合成也使用了富含不飽和脂肪酸的動植物油脂。隨著對脂肪酶基因工程和其在非水相中催化機理的深入研究，脂肪酶在非水相中的應(yīng)用將會有更加光明的前景。

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Application of immobilized lipase in nonaqueous synthesis

SUN Yue－e，WANG Wei－dong*
(College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China)

Lipase can catalyse the hydrolysis of triglycerides at the oil/water interface，but their ability to form ester bonds under reverse hydrolytic conditions enables them to catalyse various other types of reactions such as esterification and transesterification in organic solvents.Now it has been widely used in food，pharmaceutical，cosmetic and detergent industries.As a consequence of their versatility in application，lipases are regarded as enzymes of high commercial potential.Here we reviewed the reaction system，factors influencing the synthesis in non－aqueous media and application of lipase，which provided a promising prospect for further study lipase－catalysed synthesis in non－aqueous media.

lipase;non－aqueous media;synthesis

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)04－0409－04

2010－10－12 *通訊聯(lián)系人

孫月娥(1973－)，女，博士，講師，研究方向:食品脂質(zhì)氧化。