大孔樹脂吸附純化桑黃粗多糖的研究

張慧洋， 秦俊哲

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 前 言

桑黃，又名鮑氏層孔菌Phellinusigniarius，是目前發(fā)現(xiàn)的生物抗癌領(lǐng)域有效率高的大型真菌[1]，其活性成分主要是多糖.桑黃多糖具有抗腫瘤、抗菌、抗纖維化、抗氧化等藥理作用[2]，將其純化后得到的相對(duì)較純的多糖可更好地發(fā)揮作用.鑒于大孔吸附樹脂成本低、工藝簡(jiǎn)單、效率高、再生性強(qiáng)、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，本文采用大孔樹脂吸附純化桑黃粗多糖，并對(duì)其特性進(jìn)行了研究，以期為桑黃粗多糖的進(jìn)一步純化提供一種簡(jiǎn)單有效的方法，也為實(shí)現(xiàn)桑黃多糖的工業(yè)化利用提供理論參考.

1 材料和方法

1.1 材料

桑黃：陜西科技大學(xué)微生物菌種保藏室提供；桑黃粗多糖：水提醇沉法制得.

1.2 儀器

HYG-IIa旋轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜(上海鑫蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，756PC紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器)，層析柱(20×400)(江蘇省高郵市亞泰科教儀器廠).

1.3 主要試劑

苯酚、濃硫酸、95%乙醇、葡萄糖等，均為分析純.

1.4 試驗(yàn)方法

(1)多糖測(cè)定：苯酚-硫酸法[3]，得回歸方程y=0.340 1x-0.010 6，R2=0.998 8.

(2)大孔樹脂的預(yù)處理： 95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，95%乙醇以2 BV·h-1(BV指樹脂的床體積，單位mL)的流速通過樹脂柱，水洗至中性沒有醇味為止；5% HCl溶液以4 BV·h-1流速進(jìn)行酸洗，浸泡4 h，水洗至中性；再用5% NaOH溶液以4 BV·h-1流速進(jìn)行堿洗，浸泡4 h，水洗至中性，即處理完畢.

(3)靜態(tài)吸附-解吸附試驗(yàn).在100 mL錐形瓶中，加入1 g預(yù)處理過的大孔樹脂和20 mL多糖液，密封振蕩(110 r·min-1，30 ℃)24 h，抽濾，測(cè)吸附前后溶液中多糖的含量；將飽和樹脂置于100 mL錐形瓶中，加入25 mL洗脫劑(以蒸餾水和70%乙醇作對(duì)比)，密封振蕩(110 r·min-1， 30 ℃)24 h，抽濾，篩選出純化多糖性能最好的樹脂以及解吸效果好的洗脫劑.

(4)動(dòng)態(tài)吸附-解吸附試驗(yàn).將目的樹脂濕法裝柱，桑黃多糖液(流速1 mL·min-1)上樣，1 BV收集一管，測(cè)定多糖含量，確定最佳上樣量.吸附飽和后，洗脫劑洗脫(流速1 mL·min-1)，部分收集器收集，5 mL收集一管，考察多糖的解吸情況，確定最佳洗脫劑用量.

(5)計(jì)算.吸附量、吸附率和解吸率的計(jì)算見參考文獻(xiàn)[5].

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)試驗(yàn)

2.1.1 大孔吸附樹脂的篩選

圖1 5種樹脂對(duì)多糖的吸附和解吸情況 圖2 5種樹脂對(duì)粗多糖中蛋白吸附性能的紫外掃描曲線(1.多糖樣品液, 2.D101, 3.DM301, 4.DS401, 5.DA201, 6.D-101-I)

由圖1知，5種樹脂對(duì)多糖的吸附率變化差異不顯著，對(duì)比乙醇和水做洗脫劑時(shí)，乙醇的洗脫率高于水.因蛋白質(zhì)在280 nm處有最大吸收，故測(cè)得樣品溶液在280 nm處的吸光度值，可粗略估計(jì)溶液中的蛋白含量.為了進(jìn)一步確定5種樹脂的脫蛋白性能，對(duì)樹脂吸附后的多糖液在200～800 nm區(qū)間進(jìn)行了紫外掃描(圖2).由圖2知，經(jīng)樹脂處理過的多糖液在280 nm處吸收值均明顯低于原液，D-101-I的下降最多，且對(duì)多糖原液中吸收波長(zhǎng)在300～400 nm的雜質(zhì)有很好的脫除作用，有利于多糖的進(jìn)一步分離純化.綜合考慮，以D-101-I為目的樹脂，乙醇為洗脫劑做進(jìn)一步的動(dòng)態(tài)試驗(yàn).

2.1.2 吸附等溫線

圖3 D-101-I的吸附等溫曲線 圖4 D-101-I的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由圖3知，隨著溶液中多糖濃度的增大，樹脂的吸附量也隨之增大，當(dāng)濃度大于500 mg·L-1時(shí)，吸附逐漸緩慢.

2.1.3 吸附動(dòng)力學(xué)

由圖4知，在起始階段樹脂吸附量隨時(shí)間增加較快，隨著時(shí)間延長(zhǎng)吸附量增加緩慢，240 min時(shí)基本達(dá)到平衡.

圖5 pH對(duì)多糖吸附量的影響

2.1.4 pH對(duì)多糖吸附率的影響

由圖5知，在pH為5～6時(shí)對(duì)多糖的吸附量最多，這是因?yàn)槎嗵且旱膒H值為5.5，主要以分子形式存在，故易被樹脂吸附，由此，采用原液直接上柱進(jìn)行下一步的動(dòng)態(tài)試驗(yàn).

2.1.5 乙醇濃度對(duì)樹脂解吸率的影響

由表1試驗(yàn)結(jié)果可見，在乙醇濃度為50%時(shí)，解析率最大，隨乙醇濃度的進(jìn)一步增加，解析率減小，故選用50%的乙醇作洗脫劑.

2.2 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

2.2.1 上樣量對(duì)樹脂吸附性能的影響

圖6 上樣量與多糖吸附率關(guān)系曲線 圖7 洗脫劑用量與多糖解吸率關(guān)系曲線

由圖6知，隨上樣量的增加，樹脂的吸附率逐漸降低.在上樣量為1～6個(gè)柱體積時(shí)，樹脂對(duì)多糖的吸附量較大，速度快，接近飽和，而在9個(gè)柱體積時(shí)，樹脂對(duì)多糖的吸附已趨于平衡，此時(shí)樹脂吸附飽和.綜合考慮，選用6 BV作為最佳上樣量.

圖8 洗脫液多糖的紫外掃描圖

2.2.2 洗脫劑用量對(duì)樹脂解吸性能的影響

由圖7知，隨著洗脫劑用量的增加，多糖的洗脫率先增加后降低，在1 BV時(shí)，達(dá)到最高90%，2個(gè)柱體積時(shí)可基本把多糖洗脫完.在第4～7管(即20～35 mL)的多糖濃度很高，說明多糖被富集洗脫下來.合并洗脫液，去除乙醇，在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描，由圖8可知，在280 nm處基本沒有峰，說明洗脫液中蛋白含量低，故選洗脫劑用量為2 BV.

2.3 樹脂的重復(fù)利用率

由表2可以看出，當(dāng)樹脂重復(fù)使用3次后，其吸附容量會(huì)下降到50%以下，需進(jìn)行再生處理.

表1 乙醇濃度對(duì)多糖解吸率的影響

表2 樹脂的重復(fù)利用率

3 結(jié)束語

作者通過試驗(yàn)比較了5種大孔吸附樹脂對(duì)桑黃粗多糖的吸附-解吸性能，研究發(fā)現(xiàn)D-101-I樹脂對(duì)桑黃多糖有較好的純化作用.純化桑黃多糖的最佳工藝條件如下：多糖液濃度為500 mg·L-1，吸附240 min達(dá)到平衡，平衡吸附量為80 mg·g-1，多糖原液直接上柱，最佳上樣量為6 BV；50 %乙醇作洗脫劑，用量為2 BV時(shí)，可將樹脂上的多糖大部分洗脫下來，且洗脫液中蛋白及雜質(zhì)含量較少，多糖純度較高.

參考文獻(xiàn)

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[3] 李芙蓉,呂 博.刺五加多糖的微波萃取及含量測(cè)定[J].新疆中醫(yī)藥,2003,21(1):11.

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