杜仲葉多酚的提取及分離工藝研究

董文賓, 許先猛

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 前 言

杜仲(EucommiaulmoidesOliv)，我國特有的珍稀瀕危保護(hù)植物.杜仲中含杜仲膠、京尼平苷、綠原酸、槲皮素、山柰醇等多種活性成分，具有消炎抑菌、抗疲勞、抗衰老、降血壓、降血脂、補腎、安胎等諸多功效[1].研究證明[2,3]，杜仲皮與葉有著相似的化學(xué)成分和藥理作用，其各類物質(zhì)的多酚成分陸續(xù)被國內(nèi)外學(xué)者所研究[4,5].有關(guān)杜仲葉中的多酚物質(zhì)研究的報道很少，相關(guān)文獻(xiàn)大多是對綠原酸的提取和純化.本論文應(yīng)用超聲法和浸提法對杜仲葉中多酚物質(zhì)的提取條件進(jìn)行了考察與優(yōu)化，并且比較了各自的優(yōu)缺點,為杜仲葉綜合利用提供一定的理論依據(jù)，同時對杜仲葉多酚粗提物進(jìn)行了初步分離純化，也為多酚類物質(zhì)的分離純化工作奠定了一定的基礎(chǔ).

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：杜仲葉(采自陜西略陽)，陰干，粉碎過40目篩.

試劑：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，貴州遵義佳宏化工有限責(zé)任公司，純度98%；福林酚，美國Sigma公司；無水碳酸鈉，分析純，天津市百世化工有限公司.

儀器：JY92-Ⅱ超聲細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；754PC型紫外可見分光光度計及722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；BS-224型電子天平，德國SARTORIUS公司；微量移液器，芬蘭Dragonmed 公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器及SHZ-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵，上海亞榮生化儀器廠；DZ-1BC真空干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

杜仲葉→陰干→粉碎過篩→稱取→超聲提取/浸提→過濾→濃縮→干燥→粗提物

└→吸附→解吸→干燥

1.2.2 操作要點

(1)原料選擇.杜仲葉采自陜西略陽.

(2)提取.提取過程中，超聲和浸提的熱量會使乙醇提取液有不同程度的揮發(fā)，對實驗結(jié)果有一定的影響，因此在實驗過程中需制作帶孔塑料薄膜對提取容器進(jìn)行密封.

(3)濃縮.濃縮過程中溫度不超過50℃，根據(jù)乙醇溶液濃度確定真空度.

(4)吸附.杜仲葉用40%乙醇進(jìn)行提取，提取液濃縮至適當(dāng)濃度(不含乙醇)，離心，取上清液沿柱壁緩緩加入裝有樹脂的柱中，至流出液顏色和加入濃縮液顏色基本相同，靜置吸附24 h.

(5)解吸附.分別采用不同濃度乙醇對大孔樹脂吸附柱進(jìn)行洗脫.

(6)干燥.真空減壓干燥，溫度為50℃.

(7)檢測.以試劑空白做參比進(jìn)行吸光度的測定，測定過程中若吸光度過大則進(jìn)行一定比例的稀釋.

1.2.3 單因素實驗

超聲法選取超聲功率、超聲時間、乙醇濃度、料液比數(shù)等單因素進(jìn)行實驗，考察各因素對多酚得率的影

表1 多酚超聲法提取實驗因素水平表

響；浸提法選取浸提溫度、時間、乙醇濃度、料液比等單因素進(jìn)行實驗，考察各因素對多酚得率的影響.

1.2.4 正交試驗

本實驗采用L9(34)正交表，超聲法采用用超聲功率、超聲時間、乙醇濃度、料液比4個因素做正交試驗，各因素選取3個水平，實驗因素水平表見表1；浸提法采用浸提溫度、浸提時間、乙醇濃度、

表2 多酚浸提法提取實驗因素水平表

料液比4個因素做正交試驗，選取3個水平，實驗因素水平表見表2.

1.2.5 測定方法[6]

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作.準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.102 0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，制成沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液.用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，定容，濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL.

分別取上述不同濃度溶液1 mL加到10 mL容量瓶中，在每個容量瓶中分別加入5.0 mL的10%福林酚試劑，搖勻.反應(yīng)6 min后，加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水定容至刻度，搖勻.室溫下放置60 min.以試劑空白為參比，在500～900 nm之間掃描最大吸收峰，確定最大吸收波長在766 nm處.在766 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)溶液，由濃度對吸光度進(jìn)行回歸求得標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到?jīng)]食子酸濃度C(μg/mL)與吸光度A的關(guān)系的回歸方程為：y=0.022 2x+0.016 8(R2=0.999).

(2)杜仲葉多酚的測定.吸取1 mL樣液，按合適比例稀釋后按上述方法測定.以試劑空白作參比測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣液多酚得率.多酚得率=[m1/(m總×106)]×100%,式中m1=(109.890 1A-0.033 0)×稀釋倍數(shù)×V提取液,m總為所取原料質(zhì)量(g).

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲功率對多酚得率的影響

在超聲時間45 min，料液比1∶15，乙醇濃度60%條件下提取兩次，超聲功率對多酚得率的影響如圖1所示.

由圖1可以看出，超聲功率在200～400 W內(nèi)，杜仲葉多酚得率隨超聲功率的增加有所提高；當(dāng)超聲功率大于400 W時，總多酚提取量開始隨超聲功率的增加而逐漸降低.可能因為隨著超聲功率增大，當(dāng)超過400 W時產(chǎn)生的熱量(溫度超過58 ℃)使杜仲葉多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使多酚得率降低.綜合考慮，本實驗選擇超聲功率為400 W.

2.1.2 浸提溫度對多酚得率的影響

在浸提時間1 h，料液比1∶15，乙醇濃度60%條件下提取兩次，浸提溫度對多酚得率的影響如圖2所示.

圖1 超聲功率對多酚得率的影響 圖2 浸提溫度對多酚得率的影響

由圖2可以看出，隨著浸提溫度的增加多酚得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)浸提溫度為60 ℃時多酚得率最高.這可能因為溫度過低杜仲葉中的多酚溶出速度較慢，隨著溫度升高多酚的得率增加，當(dāng)溫度高于60 ℃時多酚結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，從而使多酚得率降低.綜合考慮，本實驗選擇浸提溫度為60 ℃.

2.1.3 超聲及浸提時間對多酚得率的影響

在超聲功率400 W，料液比1∶15，乙醇濃度60%條件下提取兩次；在料液比1∶15，乙醇濃度60%，浸提溫度60 ℃條件下提取兩次.超聲提取時間及浸提時間對多酚得率的影響如圖3所示.

圖3 提取時間對多酚得率的影響 圖4 乙醇濃度對多酚得率的影響

由圖3可以看出，超聲法和浸提法隨著提取時間的延長多酚的得率呈現(xiàn)上升趨勢，其中超聲時間超過45 min時多酚得率下降.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能有：(1)超聲法提取時間超過45 min后超聲產(chǎn)生的熱量(溫度超過58 ℃)使杜仲葉多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使多酚得率降低；(2)浸提法提取溫度在60 ℃溫度下，隨著時間的延長杜仲葉中多酚的溶出量越多，但多酚得率增加不明顯.綜合考慮，超聲提取實驗選擇超聲時間45 min，浸提時間選擇60 min為宜.

2.1.4 乙醇濃度對超聲法和浸提法提取多酚得率的影響

圖5 料液比對超聲法及浸提法提取多酚得率的影響

在超聲功率400 W，料液比1∶15，超聲時間45 min條件下提取兩次；在料液比1∶15，浸提時間1 h，浸提溫度60 ℃條件下提取兩次.乙醇濃度對超聲法及浸提法提取多酚得率的影響如圖4所示.

由圖4可以看出，超聲法和浸提法中隨著提取溶液乙醇濃度的增加多酚得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，其中超聲法乙醇濃度達(dá)到40%時多酚得率最大，浸提法乙醇濃度為60%時多酚得率最大.這可能是因為多酚中包含多種極性和非極性物質(zhì)，隨著乙醇濃度的增加多酚提取的總量呈現(xiàn)先增后減的趨勢.綜合考慮，超聲提取實驗選擇40%乙醇，浸提乙醇濃度選擇60%乙醇為最佳條件.

2.1.5 料液比對超聲法和浸提法提取多酚得率的影響

在超聲功率400 W，乙醇濃度40%，超聲時間45 min條件下提取兩次；在乙醇濃度60%，浸提時間1 h，浸提溫度60 ℃條件下提取兩次.料液比對超聲法及浸提法提取多酚得率的影響如圖5所示.

由圖5可以看出，隨著溶劑量的增加，多酚得率也隨之增高，但增高幅度較小.綜合考慮提取成本，本實驗采用料液比1∶15為宜.

2.2 提取最佳工藝的選擇

我們對影響多酚得率的幾個因素作了正交試驗，以期從多個因素中找出影響實驗結(jié)果的各因素的主次順序以及最優(yōu)的水平組合，實驗結(jié)果見表3.

表3 正交試驗結(jié)果與極差分析

注平行試驗3次，結(jié)果取平均值.

2.3 多酚粗提物初步分離純化

2.3.1 大孔樹脂的篩選

樹脂預(yù)處理[3]：分別選用樹脂LX-38、S-8、LS-300、LS-46、XDA-8、D-101B、LX-9、LX-60、LX-8、LS-806、LS-306、LSA-21，取適量(30 g)用1mol/L的NaOH溶液浸泡4 h，用純凈水洗至中性，然后用1 mol/L的HCl浸泡24 h，用純凈水沖洗至中性，用70%乙醇浸泡24 h備用.

圖6 大孔樹脂篩選結(jié)果

沒食子酸吸附：將預(yù)處理好的不同種類樹脂置于250 mL錐形瓶中，分別加入10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液及90 mL水，密封，于30 ℃、無光條件下，70 r/min搖床吸附12 h，過濾得到吸附飽和的大孔樹脂.

沒食子酸解吸：將過濾后的大孔樹脂置于250 mL錐形瓶中，分別加入100 mL 40%乙醇溶液，密封，于30 ℃、無光條件下，70 r/min搖床解吸30 min，過濾，測定解吸液中沒食子酸的吸光度并計算出解吸液中沒食子酸的質(zhì)量，結(jié)果如表4.

由圖6可以看出，XDA-8大孔樹脂對沒食子酸吸附效果最好，吸附量=[解吸沒食子酸質(zhì)量(g)/添加沒食子酸質(zhì)量(g)]×100%，經(jīng)計算達(dá)43.92%，因此本實驗選用XDA-8大孔樹脂對酚類物質(zhì)粗提物進(jìn)行初步的分離純化.

2.3.2 酚類物質(zhì)提取物初步分離、純化

多酚粗提物吸附：取經(jīng)預(yù)處理XDA-8大孔樹脂適量，濕法裝柱(2 cm×30 cm)至2/3柱高度，用純凈水沖洗至流出液不含有乙醇.將杜仲葉40%乙醇提取液濃縮至適當(dāng)濃度(不含乙醇)，離心，取上清液沿柱壁緩緩加入裝有樹脂的柱中，至流出液顏色和加入濃縮液顏色基本相同，靜置吸附24 h.

多酚解吸附：分別用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇對吸附后大孔樹脂進(jìn)行洗脫，每次洗脫至洗脫液無色，最后測定洗脫液中多酚的吸光度，進(jìn)一步測定經(jīng)初步分離、純化后多酚的含量([溶液中多酚質(zhì)量(g)/洗脫液干重(g)]×100%)分別為：3.41%、11.35%、2.94%、2.38%、1.35%、0.23%.結(jié)果表明：20%乙醇洗脫液中多酚含量較高，其為多酚進(jìn)一步分離、純化提供了一定的基礎(chǔ).

3 結(jié)論

(1)超聲法提取杜仲葉中多酚的最佳工藝為：A3B3C1D2，即在提取功率800 W，超聲波提取時間60 min，乙醇濃度40%，料液比1∶10 g/mL的條件下提取兩次，多酚得率為0.175%.

(3)XDA-8大孔樹脂對沒食子酸的吸附效果較好，吸附量為43.92%.

(4)大孔吸附樹脂對提取物進(jìn)行初步分離純化，20%乙醇洗脫液中多酚的含量最高為11.35%.

(5)經(jīng)長期放置的杜仲葉中多酚含量較低，這可能是多酚中含有光敏、熱敏及對氧氣敏感成分，所以作為多酚提取原料的杜仲葉應(yīng)避光、真空、陰涼條件下保存.

參考文獻(xiàn)

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