明膠酶與核因子-кB對(duì)大鼠心肌纖維化的作用及替米沙坦、氨氯地平的干預(yù)效果

商 卓，劉 麗，王 文，馬麗媛，孟憲敏

0 引 言

高血壓可導(dǎo)致心肌纖維化，表現(xiàn)為細(xì)胞外膠原的沉積［1-2］，進(jìn)而使心臟順應(yīng)性下降，冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備減少，加重心肌缺血，引起心血管不良事件。在心肌纖維化過(guò)程中，MMP起重要作用，其中屬明膠酶類的MMP-2和MMP-9與心肌纖維化的關(guān)系更為密切。抑制NF-кB可緩解動(dòng)脈縮窄大鼠心肌肥厚的作用［3］。在活體動(dòng)物模型中通過(guò)藥物早期預(yù)防心肌纖維化，探討明膠酶和NF-кB在該過(guò)程中作用的研究報(bào)道較少。文中在已成功建立的AAC大鼠高血壓心肌肥厚模型［4］的基礎(chǔ)上，早期應(yīng)用替米沙坦和苯磺酸氨氯地平進(jìn)行治療，觀察CVF的變化，測(cè)定Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量，明膠酶活性及MMP-2、MMP-9和NF-кB蛋白含量，探討上述藥物預(yù)防心肌纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組SPF級(jí)8周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體重200g～260g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供［合格證號(hào):SCXK(京)2002～2003］。實(shí)驗(yàn)獲得阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)許可。大鼠5只/籠，在恒溫(22～24℃)、恒濕(60%)，12h明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。購(gòu)入并適應(yīng)環(huán)境4d后，隨機(jī)行AAC術(shù)。假手術(shù)組開(kāi)腹后只掛線，不結(jié)扎，其他程序均與手術(shù)組相同。在成功的假手術(shù)組模型大鼠中隨機(jī)選取8只，在成功的AAC模型大鼠中隨機(jī)選取24只，分為3組:替米沙坦組(n=8)、氨氯地平組(n=8)和AAC對(duì)照組(n=8)。替米沙坦和氨氯地平組給藥劑量均為5mg(kg·d)，由東瑞制藥公司提供原藥粉劑，用蒸餾水配制為1mg/ml，每天上午9～10時(shí)灌胃給藥，每周測(cè)體重后調(diào)整給藥劑量，藥物治療組連續(xù)給藥8周。AAC組及假手術(shù)組正常進(jìn)食飲水。

1.2 組織樣品制備藥物治療8周后，注射1%戊巴比妥(50mg/kg)深度麻醉后橫斷處死大鼠。迅速分離心臟用預(yù)冷等滲鹽水清洗，分離左心室，濾紙吸干后稱重，部分置10%中性福爾馬林液中固定供組織染色。其余心室組織置-70℃保存待測(cè)。

1.3 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)及含量的測(cè)定采用苦味酸天狼猩紅偏振光法對(duì)膠原進(jìn)行特殊染色后，膠原在直接光下呈紅色，Ⅰ型膠原在偏振光下呈強(qiáng)雙折射性黃或紅色的粗纖維，Ⅲ型膠原呈弱雙折射性綠色的細(xì)纖維。用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，每個(gè)標(biāo)本選一個(gè)切片，任取5個(gè)視野中所有心肌膠原(不包括血管周圍膠原)面積之和，除以全視野面積，得出CVF。同時(shí)在偏振光視野下測(cè)定其Ⅰ型和Ⅲ型膠原IOD值作為膠原含量。

1.4 明膠酶活性測(cè)定冰凍心臟加入適量勻漿液研磨，12000×g離心10 min低溫離心后取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。用明膠酶譜電泳法分析測(cè)定MMP-2、MMP-9活性，試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥有限公司，嚴(yán)格依照說(shuō)明書(shū)操作。用凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)分析各電泳條帶的吸光度值(A)。

1.5 MMP-2、MMP-9、NF-кB蛋白含量測(cè)定用免疫印跡法進(jìn)行。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，加入蛋白樣品后電泳并轉(zhuǎn)膜，再經(jīng)封閉、一抗、二抗溫育，漂洗后加入超敏電化學(xué)發(fā)光(eletrochemiluminescence，ECL)發(fā)光液顯影。用凝膠成像系統(tǒng)分析各轉(zhuǎn)印條帶A值，計(jì)算與內(nèi)參照β-actin的比值作為半定量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SAS9.13軟件進(jìn)行。數(shù)值變量應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。如不能滿足方差分析條件，則采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌CVF和Ⅰ型、Ⅲ型膠原IOD值心肌CVF在假手術(shù)組、替米沙坦組、氨氯地平組和對(duì)照組中均呈上升趨勢(shì)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅰ型膠原IOD值和Ⅰ型膠原/Ⅲ型膠原比值也呈上升趨勢(shì)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅲ型膠原IOD值雖呈上升趨勢(shì)，但在替米沙坦組和氨氯地平組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌CVF，Ⅰ、Ⅲ型膠原IOD值，Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值(±s)Table 1 M yocardial CVF，IOD values of type-Ⅰ，-Ⅲand-Ⅰ/Ⅲin different groups of rats(±s)

表1 各組大鼠心肌CVF，Ⅰ、Ⅲ型膠原IOD值，Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值(±s)Table 1 M yocardial CVF，IOD values of type-Ⅰ，-Ⅲand-Ⅰ/Ⅲin different groups of rats(±s)

與AAC對(duì)照組比較，*P＜0.05;與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與氨氯地平組比較，△P＜0.05

組 別 n CVF(%) Ⅰ型膠原(IOD/μm2) Ⅲ型膠原(IOD/μm2) Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值A(chǔ)AC對(duì)照組 8 11.48±0.46 9753.5±456.63 922.75±54.51 10.59±0.56假手術(shù)組 8 2.50±0.19* 1656.85±51.93* 382.96±21.43* 4.34±0.36*氨氯地平組 8 6.32±0.25*# 5236.48±352.32*# 710.03±22.20*# 7.38±0.51*#替米沙坦組 8 4.55±0.21*#△ 3830.5±153.11*#△ 694.58±6.60*# 5.51±0.17*#△

2.2 明膠酶活性心肌組織中MMP-2活性在替米沙坦組和氨氯地平組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低于AAC對(duì)照組(P＜0.05)，高于假手術(shù)組(P＜0.05)。MMP-9活性在假手術(shù)組、替米沙坦組、氨氯地平組和AAC對(duì)照組中依次增加，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌明膠酶活性Figure 1 Activity of gelatinases in different groups

2.3 MMP-2、MMP-9、NF-кB蛋白含量心肌組織中MMP-2和MMP-9含量在假手術(shù)組、替米沙坦組、氨氯地平組和AAC對(duì)照組中依次增加，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NF-кB含量在假手術(shù)組、替米沙坦組、氨氯地平組和AAC對(duì)照組中也呈上升趨勢(shì)，但假手術(shù)組和替米沙坦組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蛋白含量低于AAC對(duì)照組(P＜0.05);氨氯地平組和AAC對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蛋白含量高于假手術(shù)組(P＜0.05);替米沙坦組低于氨氯地平組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌MMP-2、MMP-9與NF-кB蛋白含量Figure 2 Protein levels of gelatinases and NF-kB in different groups

3 討 論

AAC術(shù)后引起持續(xù)性心臟壓力超負(fù)荷，最終導(dǎo)致心肌纖維化。本研究中AAC對(duì)照組心肌膠原各組分含量均明顯高于假手術(shù)組，還發(fā)現(xiàn)替米沙坦和苯磺酸氨氯地平均可抑制心肌膠原組分增生，預(yù)防心肌纖維化，替米沙坦的作用比苯磺酸氨氯地平更強(qiáng)。業(yè)已證實(shí)，腎素血管緊張素系統(tǒng)(resin-angiotensin system，RAS)在心肌纖維化過(guò)程中起重要作用，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中的主要活性介質(zhì)。替米沙坦是新一代長(zhǎng)效非肽類選擇性血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑，除具有降低壓力負(fù)荷預(yù)防心肌纖維化的作用外，還可特異性與AT1受體結(jié)合，減少AngⅡ通過(guò)AT1受體介導(dǎo)引起的心肌纖維化作用，同時(shí)反饋性增加AngⅡ與AT2受體的結(jié)合，發(fā)揮保護(hù)心臟的作用［5］。而苯磺酸氨氯地平是長(zhǎng)效降壓藥，也具有改善心肌肥厚的作用［6］，主要通過(guò)降低心臟壓力負(fù)荷、改善心肌供血而抑制心肌纖維化的形成。但鈣通道阻滯劑有增加心率的作用，可能會(huì)抵消部分對(duì)心臟有益的效應(yīng)，因此苯磺酸氨氯地平抑制心肌纖維化的作用相對(duì)較弱，但與AAC對(duì)照組比較，仍可明顯抑制各心肌膠原組分的生長(zhǎng)。

在本研究中隨著明膠酶活性和含量增加，心肌膠原成分增多。應(yīng)用藥物干預(yù)抑制明膠酶后，心肌膠原成分減少。替米沙坦和苯磺酸氨氯地平兩藥均可抑制明膠酶而抑制膠原降解及聚集，預(yù)防心肌纖維化。以往研究報(bào)道多注重于明膠酶活性對(duì)心肌纖維化轉(zhuǎn)變的作用，但由于明膠酶測(cè)量時(shí)間窗不同，尚不清楚MMP-2和MMP-9在心肌纖維化過(guò)程中所起的關(guān)鍵作用［7］。已知高血壓患者血清明膠酶組分含量增加［8］。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9均在心肌纖維化過(guò)程中起作用。Sakata等［7］發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9mRNA水平增加時(shí)心肌纖維化面積增大;藥物干預(yù)后MMP-2和MMP-9水平減低，心肌纖維化面積縮小。本研究結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)論相符。本研究觀察到左心室MMP-2蛋白表達(dá)水平與其酶活性變化并不同步，提示可能存在非酶解激活途徑。

2藥物組對(duì)明膠酶的抑制程度并不相同，替米沙坦組的抑制作用更強(qiáng)，這可能是替米沙坦具有較強(qiáng)的預(yù)防心肌纖維化作用的原因之一。為進(jìn)一步探討藥物干預(yù)預(yù)防心肌纖維化的機(jī)制，我們測(cè)量了心肌組織中NF-кB蛋白含量。以往研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚的形成與NF-кB活化有關(guān)［3］，抑制NF-кB可減輕心肌肥厚［9］。我們的研究也證實(shí)心肌纖維化程度最高的AAC對(duì)照組大鼠心肌中NF-кB含量最高。通過(guò)藥物治療后NF-кB含量減少，心肌纖維化程度也隨之減輕。而且各組大鼠心肌明膠酶的活性和含量的變化趨勢(shì)也與NF-кB含量的變化一致。Esteve等［10］發(fā)現(xiàn)，NF-кB與MMP的表達(dá)密切相關(guān)，對(duì)心肌組織重構(gòu)也具有重要作用［11］。在肌肉組織中，MMP-2和MMP-9是NF-кB的目標(biāo)基因［12］。Xie等［13］發(fā)現(xiàn)，在大鼠成纖維細(xì)胞中，NF-кB的活化促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活化。MMP-9分子上存在NF-кB的結(jié)合位點(diǎn)，而NF-кB可能通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)MMP-2的調(diào)節(jié)作用［13］。2種藥物干預(yù)都不同程度降低了NF-кB含量，但替米沙坦的作用較強(qiáng)，提示替米沙坦抑制心肌纖維化的作用可能是通過(guò)減少NF-кB的生成而抑制MMP-2、MMP-9的活性與合成而實(shí)現(xiàn)的。

總之，替米沙坦、苯磺酸氨氯地平可抑制明膠酶而預(yù)防心肌纖維化，NF-кB參與了替米沙坦抑制明膠酶的過(guò)程。但NF-кB抑制明膠酶的途徑以及藥物干預(yù)是防止心肌纖維化的發(fā)生還是僅僅延緩其進(jìn)程尚有待進(jìn)一步研究。

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