SSR標(biāo)記技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種研究中的應(yīng)用

李建武

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州 730070）

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），廣泛分布在真核生物基因組的不同位置，且分布較為均勻，由于其重復(fù)次數(shù)不同或重復(fù)程度不完全而形成每個(gè)座位的多態(tài)性。SSR一般是由幾個(gè)（多為1～6個(gè)）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短，在100 bp以內(nèi)。SSR標(biāo)記技術(shù)作為第2代基于PCR的一種新型DNA分子標(biāo)記，其原理是根據(jù)SSR兩端的特定順序序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物，對(duì)SSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性，表現(xiàn)為共顯性。

SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、分布于整個(gè)基因組、特異性擴(kuò)增、發(fā)生頻率高、共顯性遺傳、對(duì)DNA數(shù)量和質(zhì)量要求不高、批量操作等優(yōu)點(diǎn)。自該技術(shù)于1991年創(chuàng)立以來，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇育種和遺傳多樣性研究等方面（Bonierbale et al.，1988），同樣在馬鈴薯構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測(cè)、目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選等研究方面也得到廣泛應(yīng)用（Collins et al.，1999；Ghislain et al.，2009）。

1 馬鈴薯SSR的發(fā)展

SSR引物的獲取途徑主要有三條：其一，直接應(yīng)用已經(jīng)公開發(fā)表的SSR引物，隨著馬鈴薯基因組測(cè)序的不斷深入和完善，公開發(fā)表的SSR標(biāo)記日益豐富；其二，使用近緣物種的引物，如利用茄科番茄的保守序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)完成 PCR（Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)（Frary et al.，2005）；其三，開發(fā)SSR引物，通過核酸數(shù)據(jù)庫GenBank、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）、EMBL（European Molecular Biology Laboratory）篩選簡(jiǎn)單重復(fù)DNA序列，或從已建立的克隆文庫中獲得簡(jiǎn)單重復(fù)DNA序列的陽性克隆，然后根據(jù)其兩側(cè)保守的DNA序列設(shè)計(jì)特定的SSR引物。

1.1 馬鈴薯基因組SSR引物的開發(fā)

Veilleux等（1995）首次將 SSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在馬鈴薯花藥培養(yǎng)再生二倍體植株的遺傳分析上。馬鈴薯和番茄分子連鎖遺傳圖譜的深入研究證明了馬鈴薯和番茄高度保守區(qū)域的相似性（Bonierbale et al.，1988；Tanksley et al.，1992），隨著番茄SSR引物的不斷開發(fā)，也相應(yīng)地增加了馬鈴薯SSR引物的數(shù)量，促進(jìn)了SSR標(biāo)記在馬鈴薯研究中的應(yīng)用。馬鈴薯SSR的引物開發(fā)與篩選研究始于1996年，Provan等（1996）根據(jù)番茄和馬鈴薯的24個(gè)功能基因中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列設(shè)計(jì)了22對(duì)SSR引物，其中19對(duì)引物具有多態(tài)性。Mibourne等（1998）利用EMBL、cDNA文庫和富集小片段插入DNA文庫中的馬鈴薯簡(jiǎn)單重復(fù)序列，共設(shè)計(jì)了112對(duì)SSR引物（STM001系列），對(duì)4個(gè)二倍體和2個(gè)四倍體馬鈴薯無性系進(jìn)行了遺傳分析，其中的98對(duì)SSR引物具有多態(tài)性。Ashkenazi等（2001）通過建立的二倍體馬鈴薯栽培種富利哈種（Solanum phurejaJuz.）和野生種恰柯種（S. chacoenseBitt.）的2個(gè)基因組文庫，設(shè)計(jì)了30對(duì)新的SSR引物。

1.2 基于EST的SSR標(biāo)記

SSR標(biāo)記的傳統(tǒng)開發(fā)涉及一系列繁復(fù)的操作過程，效率較低，成本較高，限制了SSR標(biāo)記在許多馬鈴薯遺傳分析中的應(yīng)用，長(zhǎng)期以來僅在模式植物或者經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物上得到開發(fā)和應(yīng)用。隨著表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tags，ESTs）的大量測(cè)定，快速增長(zhǎng)的EST序列信息為 SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了豐富的資源。截止到 2011年初，NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的EST數(shù)據(jù)庫收錄了逾39萬條馬鈴薯EST序列。Ghislain等（2004）根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)了48對(duì)SSR引物，經(jīng)過篩選最后得到了13個(gè)新的SSR標(biāo)記（STM5000系列）。Feingold等（2005）通過美國(guó)基因組研究所（The Institute for Genomic Research，TIGR）數(shù)據(jù)庫的馬鈴薯基因組簡(jiǎn)單重復(fù)序列，設(shè)計(jì)了94對(duì)引物，經(jīng)合成后擴(kuò)增馬鈴薯DNA，成功開發(fā)了61個(gè)SSR標(biāo)記（STI系列），這些SSR引物能夠鑒別選自南美的30個(gè)馬鈴薯品種。馬鈴薯SSR標(biāo)記的不斷開發(fā)及引物序列的公開發(fā)表，極大地促進(jìn)了SSR技術(shù)在馬鈴薯品種鑒定及遺傳多樣性等方面的研究。

2 SSR標(biāo)記在馬鈴薯遺傳育種方面的應(yīng)用

2.1 品種鑒定與種質(zhì)資源研究

SSR標(biāo)記從DNA分子水平上對(duì)馬鈴薯品種進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確、高效、批量鑒別出不同的基因型，已成為一種有效的鑒定方法，結(jié)合SSR標(biāo)記的多態(tài)性及其精確的片段大小，即可建立對(duì)應(yīng)于每一品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，將為品種在分子水平上提供獨(dú)特的鑒定特征，以鑒別品種。Kawchuk等（1996）利用3對(duì)SSR引物在95個(gè)馬鈴薯栽培品種擴(kuò)增出了851個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，區(qū)分了其中的73個(gè)品種。McGregor等（2000）利用SSR標(biāo)記對(duì)39個(gè)南美當(dāng)?shù)伛R鈴薯栽培品種進(jìn)行了分析，5對(duì)SSR引物有效區(qū)分了其中的24個(gè)。Ashkenazi等（2001）利用4對(duì)公開的SSR引物和根據(jù)基因組文庫開發(fā)的3對(duì)新的SSR引物共7對(duì)，可以鑒定區(qū)別12個(gè)不同的馬鈴薯栽培品種，且其中的2對(duì)SSR引物可完全鑒別出這些品種，多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3～6，平均等位基因數(shù)為5。Norero等（2002）利用SSR標(biāo)記對(duì)來自德國(guó)等12個(gè)國(guó)家的37個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行了分子鑒定，3對(duì)引物可將其中的36個(gè)品種區(qū)分開，由于Shepody和Achirana INTA兩個(gè)品種出現(xiàn)了相似的特異性譜帶，利用另外一對(duì)引物將其區(qū)分開，即4對(duì)SSR引物可將所有37個(gè)品種完全區(qū)分。Ghislain等（1999）利用70個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)來自國(guó)際馬鈴薯中心（CIP）的9個(gè)類型（且每個(gè)類型不少于4個(gè)基因型）的73個(gè)馬鈴薯種質(zhì)材料進(jìn)行了擴(kuò)增，篩選了包含18個(gè)具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記可在7大栽培種中均擴(kuò)增出該多態(tài)性片段，可以有效地區(qū)分不同品種。Ghislain等（2004）利用156對(duì)SSR引物對(duì)來自CIP的8個(gè)類型的931個(gè)馬鈴薯種質(zhì)材料進(jìn)行了分析，篩選出的18對(duì)SSR引物可高效、準(zhǔn)確地鑒定馬鈴薯種質(zhì)資源。Ghislain等（2009）利用88個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)來自CIP保存4大類型的742份馬鈴薯種質(zhì)資源（包含二倍體、三倍體、四倍體、五倍體）進(jìn)行了分析，建立了含有 51個(gè) SSR標(biāo)記馬鈴薯遺傳鑒定試劑盒，該試劑盒鑒定區(qū)別742份種質(zhì)資源的有效性達(dá)到98.8%，而含有其中的24個(gè)SSR標(biāo)記的試劑盒鑒定區(qū)別這些種質(zhì)資源的有效性可達(dá) 93.5%，同時(shí)明確了標(biāo)記等位基因片段大小，新的遺傳鑒定試劑盒有助于馬鈴薯種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化選擇和分析數(shù)據(jù)。Rosa等（2010）利用24個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)巴西的14個(gè)馬鈴薯主栽品種進(jìn)行了分析，篩選出可以鑒定這些品種的2個(gè)SSR標(biāo)記，且每一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均為單形態(tài)帶型。

我國(guó)在馬鈴薯品種鑒定、指紋圖譜及遺傳多樣性方面的研究近幾年發(fā)展較快，段艷鳳等（2009）利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了中國(guó)2000～2007年審定的88個(gè)馬鈴薯品種的指紋圖譜并進(jìn)行了遺傳多樣性分析，從138對(duì)SSR引物中篩選出6對(duì)引物構(gòu)建了88個(gè)品種的SSR指紋圖譜。王紹鵬等（2009）利用4對(duì)SSR引物對(duì)黑龍江省7個(gè)主栽品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，共獲得144條多態(tài)性條帶，其中3對(duì)引物完全可以區(qū)分7個(gè)馬鈴薯品種，剩余1對(duì)引物可以區(qū)分6個(gè)馬鈴薯品種，相似度分析表明，荷蘭15與克新1號(hào)遺傳距離較遠(yuǎn)，荷蘭15與早大白、早大白與黃麻子間遺傳距離較近。滕長(zhǎng)才等（2009）利用30對(duì)SSR引物對(duì)青海省12份馬鈴薯主栽品種進(jìn)行了遺傳分析，擴(kuò)增出359條多態(tài)性條帶，12個(gè)品種的遺傳距離介于0.238 5～0.480 1 cM之間，平均值為0.397 6 cM，品種遺傳多樣性水平較低。唐銘霞等（2010）從110對(duì)引物中篩選出16對(duì)SSR引物對(duì)四川省現(xiàn)有及引進(jìn)的42份馬鈴薯材料進(jìn)行遺傳分析，共擴(kuò)增出130個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn) 116個(gè)，占總擴(kuò)增位點(diǎn)的 89.2%，聚類分析表明，四川省栽培的馬鈴薯品種遺傳多樣性水平較低，品種間的遺傳差異較小。

2.2 構(gòu)建遺傳連鎖圖譜與基因定位

遺傳圖譜（Genetic map）是通過遺傳重組交換結(jié)果進(jìn)行連鎖分析所得到的基因在染色體上相對(duì)位置的排列圖，是植物遺傳育種及分子克隆等應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。高密度的遺傳連鎖圖譜是遺傳學(xué)家所追求的理想圖譜，也是分子標(biāo)記輔助選擇育種的前提和基礎(chǔ)。馬鈴薯二倍體野生種和四倍體栽培種遺傳組成上高度雜合，自交退化現(xiàn)象嚴(yán)重，很難構(gòu)建真正意義上的重組自交系，用于遺傳圖譜構(gòu)建的群體多為 F1，其每粒實(shí)生種子都代表完全不同的基因型，通過無性繁殖的方式可以固定下來，相當(dāng)于其他作物的 F2。自從美國(guó)康奈爾大學(xué) Bonierbale 等（1988）利用二倍體S. phureja×（S. tuberosum×S. chacoense）雜交后代構(gòu)建了第一個(gè)馬鈴薯RFLP圖譜以后，國(guó)外許多學(xué)者以不同的二倍體馬鈴薯材料為作圖群體，采用RFLP、AFLP、CAPS、SCAR、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了多張馬鈴薯分子遺傳圖譜，極大地增加了馬鈴薯分子遺傳圖譜密度（Tanksley et al.，1992；Collins et al.，1999）。值得注意的是，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)van Os 等（2006）發(fā)表的以二倍體SH83-92-488×RH89-039-16雜交后代F1136個(gè)基因型為作圖群體，利用AFLP、SSR、RFLP、CAPS、SCAR分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建的馬鈴薯“超密圖譜”（UHD），包含12個(gè)連鎖群，總共含有10 365個(gè)標(biāo)記，平均每個(gè)厘摩（cM）就有10個(gè)以上標(biāo)記，是目前世界上密度最大的馬鈴薯分子連鎖圖譜。S?rensen等（2008）利用包含 186個(gè)基因型的馬鈴薯雙單倍體的BC1群體，借助AFLP和SSR標(biāo)記對(duì)其親本分別構(gòu)建了含15個(gè)連鎖群的分子遺傳連鎖圖譜，獲得分別含有158、137個(gè)標(biāo)記的兩套圖譜，長(zhǎng)度分別為882、1 099 cM，其中在Ⅰ染色體上分別含SSR標(biāo)記為6、5個(gè)。

Luo等（2000）創(chuàng)建了根據(jù)同源四倍體親本及全同胞子代表現(xiàn)型篩選的遺傳標(biāo)記預(yù)測(cè)四倍體個(gè)體基因型理論與統(tǒng)計(jì)方法，并以蘇格蘭作物研究所四倍體中間材料12601ab1與 Stirling親本及其74個(gè)F1基因型為模擬作圖群體，利用一組SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)模擬構(gòu)建了一張四倍體馬鈴薯遺傳圖譜。Hackett和Luo（2003）開發(fā)出適用于同源四倍體物種構(gòu)建連鎖圖譜的Tetraploid Map軟件，為四倍體馬鈴薯分子連鎖圖譜的構(gòu)建提供了理論支持和技術(shù)保障。根據(jù)同源四倍體的基因型理論、統(tǒng)計(jì)方法與Tetraploid Map軟件，Bradshaw等（2008）以12601ab1×Stirling雜交后代F1227個(gè)基因型為作圖群體，利用38對(duì)AFLP引物組合和6對(duì)SSR引物構(gòu)建了兩個(gè)親本含有514個(gè)標(biāo)記的12個(gè)連鎖群的四倍體分子遺傳連鎖圖，其中母本12601ab1遺傳圖譜上有293個(gè)SSR標(biāo)記，父本 Stirling遺傳圖譜上有 221個(gè) SSR標(biāo)記，通過超高密度圖譜的定位信息，利用 SSR標(biāo)記STM3160和STM5140、STM3179和STM5148分別對(duì)Ⅳ、Ⅴ染色體進(jìn)行精確鑒定，為準(zhǔn)確構(gòu)建遺傳圖譜提供了重要信息。

我國(guó)關(guān)于馬鈴薯分子遺傳圖譜的研究較少，金黎平等（2007）利用二倍體08675221×09901201雜交后代F1125個(gè)基因型通過AFLP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了我國(guó)第一張馬鈴薯遺傳連鎖圖譜，母本圖譜含75個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群長(zhǎng)度為512 cM，父本圖譜含95個(gè)標(biāo)記，12個(gè)連鎖群長(zhǎng)度為578 cM。單友蛟等（2010）利用上述親本F1167個(gè)基因型為作圖群體，應(yīng)用SSR標(biāo)記構(gòu)建了一張二倍體馬鈴薯分子遺傳圖譜，其總長(zhǎng)度為645 cM的遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含86個(gè)SSR標(biāo)記，且較為均勻分布在各染色體上，每個(gè)染色體上的標(biāo)記數(shù)為3～13個(gè)，距離為2～128 cM，標(biāo)記間平均距離為7.5 cM。

較多的遺傳圖譜研究結(jié)合AFLP與SSR標(biāo)記技術(shù)，相對(duì)于多態(tài)性較強(qiáng)的AFLP，SSR標(biāo)記只擴(kuò)增 1個(gè)位點(diǎn)，具有通用性，有利于比較以不同遺傳背景構(gòu)建的多張遺傳圖譜，這對(duì)于確定連鎖群所屬的染色體以及基因位點(diǎn)具有重要的意義。

基因定位是篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，它是基因圖位克隆和分子輔助選擇育種的前提。近年來，國(guó)外開展了許多馬鈴薯抗病蟲和農(nóng)藝性狀及加工品質(zhì)性狀QTL定位的研究，如：抗晚疫?。∣berhagemann et al.，1999；Wickramasinghe et al.，2009）、抗蟲（Caromel et al.，2003）、休眠期（Freyre et al.，1994a；?liwka et al.，2008）、產(chǎn)量（Sch?fer-Pregl et al.，1998；Bradshaw et al.，2008）、淀粉含量（Sch?fer-Pregl et al.，1998；Bradshaw et al.，2008）、還原糖含量（Menendez et al.，2002；Li et al.，2005）、花青素含量（Zhang et al.，2009）及油炸顏色（D’hoop et al.，2008；Bradshaw et al.，2008）等。以二倍體馬鈴薯為材料，F(xiàn)reyre和Douches（1994b）將控制塊莖比重的10個(gè)QTLs定位在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ等染色體上；Schafer-Pregl等（1998）將控制淀粉含量的18個(gè)QTLs定位在12個(gè)連鎖群上，同時(shí)將控制產(chǎn)量的8個(gè)QTLs定位在8個(gè)連鎖群上；Chen等（2001）將編碼控制淀粉代謝酶的17個(gè)QTLs定位在12個(gè)連鎖群上。以四倍體馬鈴薯為材料，Li等（2008）將解釋 54.0%的淀粉含量表型變異的 10個(gè) QTLs定位在Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅺ等連鎖群上，同時(shí)將解釋26.1%淀粉產(chǎn)量表型變異的6個(gè)QTLs定位在Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ等連鎖群上，其中用SSR標(biāo)記在Ⅺ染色體上與STM0037緊密連鎖的等位基因?qū)Φ矸酆康呢暙I(xiàn)率為5.5%，對(duì)炸片色澤貢獻(xiàn)率2.7%；Bradshaw等（2008）利用四倍體馬鈴薯親本及其全同胞子代，對(duì)干物質(zhì)含量、抗瘡痂病等16個(gè)農(nóng)藝性狀和加工品質(zhì)性狀進(jìn)行了定位分析，總共定位了39個(gè)QTL，其中在第Ⅴ染色體上定位了1個(gè)貢獻(xiàn)率為56%的熟性QTL，同時(shí)在Ⅴ染色體上定位了1個(gè)貢獻(xiàn)率為9.7%的干物質(zhì)含量QTL。Khu等（2008）以四倍體馬鈴薯抗環(huán)腐病與易感環(huán)腐病雜交后代 92個(gè)基因型為分離群體，將一個(gè)重要的貢獻(xiàn)率為 43%的抗環(huán)腐病 QTL定位在第11號(hào)染色體上，同時(shí)檢測(cè)到了一個(gè)較小的貢獻(xiàn)率為12%的抗環(huán)腐病QTL；McCord等（2011）以四倍體馬鈴薯親本及全同胞子代 163個(gè)基因型為作圖群體，構(gòu)建了兩個(gè)親本的連鎖圖譜，即易發(fā)生熱壞死生理病害品種大西洋13個(gè)連鎖群，抗熱壞死B1829-5品系14個(gè)連鎖群，并將抗熱壞死QTL定位在第4、5、7連鎖群上，且1個(gè)SSR標(biāo)記與兩個(gè)群體的熱壞死癥狀緊密關(guān)聯(lián)。

我國(guó)關(guān)于馬鈴薯農(nóng)藝性狀與品質(zhì)性狀基因定位的研究較少，金黎平（2006）以二倍體為材料，通過AFLP和SSR標(biāo)記，采用區(qū)間作圖和多QTL復(fù)合作圖方法對(duì)4種加工及農(nóng)藝性狀進(jìn)行了QTL定位及遺傳效應(yīng)分析，在親本遺傳圖譜的10個(gè)連鎖群上，共檢測(cè)到39個(gè)QTL。其中控制炸片顏色的QTL 19個(gè)，控制干物質(zhì)含量的QTL 13個(gè)，控制單株結(jié)薯數(shù)的QTL 7個(gè)，沒檢測(cè)到控制單個(gè)塊莖質(zhì)量的QTL。單友蛟等（2010）以二倍體為材料，通過SSR標(biāo)記與復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)馬鈴薯塊莖相關(guān)的3 個(gè)重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL定位和遺傳效應(yīng)分析，結(jié)果在第5條染色體上檢測(cè)到控制3個(gè)塊莖性狀的QTL各1個(gè)，其中控制單株產(chǎn)量的QTL 遺傳貢獻(xiàn)率為12.3%，控制單薯質(zhì)量的QTL遺傳貢獻(xiàn)率為16.1%，控制塊莖比重的QTL遺傳貢獻(xiàn)率為11.2%。

2.3 分子標(biāo)記輔助育種

分子標(biāo)記輔助育種（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，借助分子標(biāo)記對(duì)育種材料在DNA水平上早期有目標(biāo)地進(jìn)行選擇，避免了依賴于表型特征間接推斷其基因型，從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良。與傳統(tǒng)的根據(jù)基因型反映出來的表型性狀選擇相比，分子標(biāo)記輔助育種具有在早期世代和植株生長(zhǎng)的任何階段進(jìn)行，SSR分子標(biāo)記共顯性的特點(diǎn)可以在雜合體階段鑒定隱性基因，對(duì)目標(biāo)基因的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)，尤其是針對(duì)處于雜合狀態(tài)的同源四倍體馬鈴薯更為重要。

Bormann等（2004）以易感晚疫病品種Leyla為父本，分別以較強(qiáng)田間抗性的Escort（含有特異基因R1、R2、R3、R10）和 Nikita（至少含有特異基因R1）品種為母本，分別在兩個(gè)雜交后代F1分離群體中選取熟性且對(duì)晚疫病抗性不同的84、95個(gè)基因型，利用定位在連鎖群上（除第10個(gè)連鎖群外）的30個(gè)基于PCR的標(biāo)記對(duì)篩選，根據(jù)田間熟性評(píng)價(jià)和對(duì)晚疫病抗性鑒定結(jié)果，認(rèn)為熟性、抗晚疫病基因標(biāo)記在Nikita后代群體對(duì)表型貢獻(xiàn)率為38%，而對(duì)Escort后代表型貢獻(xiàn)率僅為15%，這與其母本的遺傳差異有關(guān)，并提出了分子輔助選擇的實(shí)驗(yàn)性方案。Carrasco等（2009）設(shè)計(jì)了持久抗晚疫病分子輔助選擇育種策略，即通過高通量標(biāo)記將主效R基因或晚疫病抗性QTL導(dǎo)入骨干育種材料中，其程序主要分為：第一，將對(duì)抗晚疫病貢獻(xiàn)率大的數(shù)量性狀基因PiXspg精細(xì)定位；第二，轉(zhuǎn)換基于SNP和AFLP標(biāo)記為易于應(yīng)用的標(biāo)記；第三，對(duì)存在R基因的子代綜合評(píng)價(jià)晚疫病抗性和農(nóng)藝性狀；第四，將新的抗性資源通過回交方式導(dǎo)入馬鈴薯，利用與晚疫病抗性基因Rpi-phu1緊密連鎖的標(biāo)記GP94對(duì)育種材料進(jìn)行篩選；第五，在田間進(jìn)行評(píng)價(jià)馬鈴薯無性系對(duì)晚疫病抗性的提高程度；第六，通過倍性培育抗性群體和篩選標(biāo)記完善分子輔助抗病性育種。Wickramasinghe等（2009）以具有晚疫病抗性的二倍體雜交后代分離群體為研究材料，以3個(gè)分子標(biāo)記OPA17559（距對(duì)晚疫病抗性貢獻(xiàn)率為23.4%的QTL 12 cM）、OPA03576、GP198F-1（來源于RFLP標(biāo)記GP198，與對(duì)晚疫病抗性貢獻(xiàn)率為23.4%的QTL緊密連鎖），經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)它們的存在與晚疫病抗性高度相關(guān)，認(rèn)為這3個(gè)標(biāo)記對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇抗晚疫病育種非常有效。Moloney等（2009）將對(duì)抗馬鈴薯白線蟲變種Pa2/3貢獻(xiàn)率大的一個(gè)數(shù)量位點(diǎn)GpaIVsadg定位在第5連鎖群上，在含該位點(diǎn)的C1992/31育種材料和易感品種Record雜交的F1群體中鎖定該目標(biāo)位點(diǎn)，利用與該位點(diǎn)緊密連鎖SSR標(biāo)記STM3016和SNP多態(tài)性C237（119）篩選回交子代的 178個(gè)基因型，結(jié)果表明，分子標(biāo)記輔助策略對(duì)選擇持久、高抗馬鈴薯白線蟲變種Pa2/3品種有效。Sagredo等（2009）在71個(gè)育種親本（其中30個(gè)具有一定程度的抗性，17個(gè)攜帶RYSC3標(biāo)記）組配雜交組合后代中，利用與高抗馬鈴薯Y病毒Ryadg基因連鎖的序列特異性擴(kuò)增區(qū)（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）標(biāo)記RYSC3進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)不同組合共460個(gè)子代中有299個(gè)基因型含RYSC3標(biāo)記且抗Y病毒，除一個(gè)選擇不準(zhǔn)確外；在不含RYSC3標(biāo)記其他群體中有22.5%表現(xiàn)為抗Y病毒，可能存在其他R抗性基因。結(jié)果表明，在選育高抗馬鈴薯Y病毒品種過程中，采用RYSC3標(biāo)記輔助選擇含Ryadg基因的子代是有效性的，達(dá)到97.7%。

3 展望

栽培馬鈴薯為同源四倍體無性繁殖作物，為四體遺傳，其規(guī)律非常復(fù)雜。馬鈴薯育種過程中存在許多困難，包括細(xì)胞高度雜合性、基因分離復(fù)雜、花粉不育、雜交不親和、現(xiàn)有栽培種基因庫狹窄、缺乏抗病和抗逆基因。馬鈴薯種質(zhì)資源中 75%以上為二倍體野生種，通過孤雌生殖誘導(dǎo)雙單倍體和2n配子等方法將優(yōu)良品質(zhì)和抗病基因?qū)朐耘喾N，再利用分子標(biāo)記輔助選擇策略豐富拓寬基因庫和加速培育優(yōu)質(zhì)高抗（抗病、抗蟲、抗逆）品種。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種較為快捷、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記，通過將質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀基因的精細(xì)定位，開發(fā)出大量與之緊密連鎖的SSR標(biāo)記，其在馬鈴薯遺傳育種研究中的應(yīng)用前景將更加廣闊。

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