分子標(biāo)記技術(shù)在斑潛蠅中的應(yīng)用進(jìn)展

王帥宇, 雷仲仁, 董保信, 任寶珍, 盧增全

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193; 2.山東省植物保護(hù)總站,濟(jì)南 250100)

分子標(biāo)記技術(shù)在斑潛蠅中的應(yīng)用進(jìn)展

王帥宇1,2, 雷仲仁1*, 董保信2, 任寶珍2, 盧增全2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193; 2.山東省植物保護(hù)總站,濟(jì)南 250100)

斑潛蠅是農(nóng)作物、蔬菜和花卉等植物上的重要害蟲(chóng),尤其是美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅和三葉斑潛蠅的入侵,給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和對(duì)外貿(mào)易帶來(lái)重大損失。采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類特征對(duì)斑潛蠅進(jìn)行鑒定極易混淆,更難進(jìn)行地理分布與遺傳多樣性分析,近年來(lái)迅速發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)為解決斑潛蠅遺傳及鑒定等問(wèn)題提供了有效的手段。本文主要概述了DNA分子標(biāo)記技術(shù)在斑潛蠅的分子鑒定、地理分布及傳播途徑、種群遺傳分化及種間雜交等方面的應(yīng)用現(xiàn)狀,并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

分子標(biāo)記技術(shù); 斑潛蠅; 分子鑒定; 傳播途徑; 種群遺傳分化

斑潛蠅屬于雙翅目(Diptera)、潛蠅科(Agromyzidae)、植潛蠅亞科(Phytomynidae)。其中美洲斑潛蠅(Liriomyza sativae)、南美斑潛蠅(L.huidobrensis)、三葉斑潛蠅(L.tri folii)等是世界重要的檢疫性害蟲(chóng),其暴發(fā)為害時(shí)給農(nóng)作物、蔬菜和花卉等帶來(lái)巨大損失,嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致作物絕產(chǎn)[1]。近年來(lái),斑潛蠅仍在不斷擴(kuò)散,目前在南、北美洲、大洋洲、非洲和亞洲等30多個(gè)國(guó)家均有發(fā)生,嚴(yán)重威脅分布地的農(nóng)作物、蔬菜、花卉等安全生產(chǎn)。

由于斑潛蠅個(gè)體較小,并且很多種類形態(tài)上極其相似,僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定很難區(qū)分。同時(shí),斑潛蠅作為一種入侵害蟲(chóng),對(duì)其傳入途徑和地理分布與遺傳多樣性的了解,可為其持續(xù)控制提供更多的科學(xué)依據(jù),而獲得這些信息,傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)與生理生化方法很難實(shí)現(xiàn)。分子標(biāo)記技術(shù)具有信息含量高、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、不易受環(huán)境變化和發(fā)育情況影響等優(yōu)點(diǎn),在揭示物種不同水平的遺傳變異研究中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前多種分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于昆蟲(chóng)學(xué)研究[2-5],限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA以及核內(nèi)與線粒體部分基因序列等已逐步應(yīng)用于斑潛蠅研究[6-10]。本文概述了DNA分子標(biāo)記技術(shù)及其在斑潛蠅中的應(yīng)用現(xiàn)狀,并對(duì)其在斑潛蠅的應(yīng)用前景進(jìn)行了分析和展望。

1 DNA分子標(biāo)記概述

DNA分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展主要分為3個(gè)階段:第1代分子標(biāo)記是由Botesin提出的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP)。對(duì)于RFLP而言,主要是存在大量不同識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶與基于高變區(qū)內(nèi)的大量探針可供選擇。但由于需要使用放射性標(biāo)記的探針,安全性低而且試驗(yàn)成本增加。改良后的PCRRFLP,雖不需要標(biāo)記及探針,酶切后產(chǎn)物可直接電泳,但如果片段太小或距離過(guò)近,將會(huì)影響對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析。第2代分子標(biāo)記以PCR技術(shù)為核心,包括以隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(inter-simple sequence repeat,ISSR)等分子標(biāo)記。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,大大降低了對(duì)樣品數(shù)量和質(zhì)量要求。方法簡(jiǎn)單,省時(shí)省力,而且穩(wěn)定性和多態(tài)性高,為研究帶來(lái)很大便利。另外,利用PCR技術(shù)對(duì)特定DNA區(qū)域擴(kuò)增,如對(duì)核糖體DNA和線粒體DNA一些基因片段的研究,因其直觀性和真實(shí)性也受到研究者的青睞,目前已得到廣泛應(yīng)用。第3代分子標(biāo)記以單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)為主,是個(gè)體間由完全相同序列界定的單個(gè)核苷酸的差異(單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失),建立在DNA芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上,與其他分子標(biāo)記相比,SNP分辨率最高也最為豐富,覆蓋基因組范圍大,遺傳上也較穩(wěn)定[11-15]。

上述每種分子標(biāo)記均有各自的優(yōu)缺點(diǎn),無(wú)法滿足理想的遺傳標(biāo)記的所有要求,使用中應(yīng)根據(jù)研究的需要選擇相應(yīng)的標(biāo)記技術(shù)。

2 斑潛蠅的分子鑒定

斑潛蠅屬內(nèi)有多種在形態(tài)上極其相似,如南美斑潛蠅、番茄斑潛蠅、美洲斑潛蠅、三葉斑潛蠅等,僅依靠形態(tài)學(xué)特征很難區(qū)分。并且斑潛蠅種內(nèi)存在高度的遺傳分化,甚至存在隱種[9,16],正確鑒定其種類是可持續(xù)控制的基礎(chǔ),對(duì)于制定科學(xué)有效的綜合治理策略具有重要的指導(dǎo)意義。

當(dāng)前在斑潛蠅近緣種鑒定應(yīng)用較多的為mtDNA基因組中的COⅠ、COⅡ基因序列和rDNA的ITS區(qū)域。其中,Ochando等和邱一中等采用RAPD-PCR方法分別得到了南美斑潛蠅的特異條帶和鑒定6種斑潛蠅的3條引物[5,7],初步實(shí)現(xiàn)了斑潛蠅的分子鑒定,但RAPD存在重復(fù)性差等缺點(diǎn)。Masetti等運(yùn)用RFLP-PCR,以COⅠ序列為靶標(biāo),對(duì)同時(shí)發(fā)生在意大利的萵苣類作物上的南美斑潛蠅、三葉斑潛蠅和番茄斑潛蠅進(jìn)行了研究,得到了南美斑潛蠅特異性酶切位點(diǎn),從而可從分子水平快速有效地區(qū)分南美斑潛蠅與三葉斑潛蠅和番茄斑潛蠅[6]。管維等通過(guò)擴(kuò)增三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅的ITS序列,進(jìn)一步篩選得到了可以區(qū)分三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅的特異性酶切位點(diǎn)[11]。最近,陳萍等在原來(lái)研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)分析斑潛蠅COⅡ基因序列變異,采用3種限制性內(nèi)切酶,得到了三葉斑潛蠅、美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、番茄斑潛蠅和蔥斑潛蠅的特征酶切位點(diǎn),建立了PCR-RFLP分子標(biāo)記對(duì)該5種斑潛蠅種類的檢測(cè)鑒定方法[17-18],此方法比RAPD結(jié)果更穩(wěn)定可靠,但PCR擴(kuò)增完成后需再進(jìn)行酶切,降低了檢測(cè)的時(shí)效性。

另外,一些學(xué)者通過(guò)直接比較不同基因序列差異來(lái)獲得用于鑒定斑潛蠅的分子標(biāo)記,Scheffer通過(guò)直接比較線粒體DNA中的COⅠ和COⅡ基因序列變化,證明美國(guó)南美斑潛蠅有隱種(cryptic species)存在,美國(guó)北部的南美斑潛蠅與南部和中部的南美斑潛蠅相比有明顯的變異,認(rèn)為北部的斑潛蠅應(yīng)為L(zhǎng).langei,它不是南美斑潛蠅的同物異名,而是不同種[16]。馮賢等建立了利用COⅠ序列鑒定三葉斑潛蠅的實(shí)時(shí)鑒定體系,王莉萍在ITS序列中找到了不同近緣種的特異性識(shí)別位點(diǎn),可以作為美洲斑潛蠅與其他3個(gè)近緣種種間鑒別的分子標(biāo)記[8]。Miura利用多重PCR對(duì)番茄上的三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅的COⅠ序列進(jìn)行了擴(kuò)增,三葉斑潛蠅可擴(kuò)增出2條帶,而美洲斑潛蠅擴(kuò)增出3條帶片段,而且不同地理區(qū)域,性別、發(fā)育周期結(jié)果一致,實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單快速區(qū)分兩近緣種[19]。利用DNA直接測(cè)序,結(jié)果更直觀,更準(zhǔn)確,但成本高、周期長(zhǎng)。從上述研究結(jié)果可以看出,分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為斑潛蠅近緣種的分子鑒定提供了豐富的證據(jù)。但這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn),今后還需要在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步尋找簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確的近緣種鑒定分子標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增直接檢測(cè)條帶有無(wú)或片段長(zhǎng)度大小差異即可區(qū)分近緣種。

3 斑潛蠅的地理分布與傳播途徑分析

了解斑潛蠅的地理分布及其傳播途徑,對(duì)于明確其入侵過(guò)程,尋找及引進(jìn)天敵,闡明斑潛蠅在入侵過(guò)程中或入侵后的生物學(xué)變化,預(yù)測(cè)入侵定殖后的生物學(xué)特性以及借鑒有效的防治措施等具有重要的意義。

Scheffer利用 COⅠ和 COⅡ基因序列聯(lián)合分析,認(rèn)為世界很多區(qū)域的南美斑潛蠅都是從美洲的南部和中部傳入的[16]。何麗萍運(yùn)用線粒體DNA中的COⅡ基因序列研究南美斑潛蠅在云南的分布、起源,得出云南的南美斑潛蠅與美洲的不同種群在基因樹(shù)上聚為一類,親緣關(guān)系最近,也得出了云南的南美斑潛蠅乃是從美洲傳入的,這與Scheffer得到的結(jié)果一致[16,20]。但利用分子標(biāo)記技術(shù)研究斑潛蠅的地理分布和傳播途徑分析還未見(jiàn)報(bào)道。另外,外來(lái)入侵種傳播方式復(fù)雜,能夠成功定殖有可能經(jīng)歷了多次入侵,而且定殖后又可能成為新的入侵源[21],這就需要進(jìn)一步擴(kuò)大分子標(biāo)記技術(shù)在斑潛蠅研究中的應(yīng)用范圍,從多方面對(duì)不同地區(qū)、不同種類斑潛蠅進(jìn)行更系統(tǒng)、更深入的研究。

4 斑潛蠅種群的遺傳分化

斑潛蠅作為外來(lái)入侵物種,在入侵過(guò)程中,不同種群在食性、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、抗藥性等方面發(fā)生了很大的變化,這可能與種群基因突變、基因流動(dòng)、遺傳漂變、選擇壓力等有關(guān),對(duì)其遺傳機(jī)制的研究主要借助于分子生物學(xué)手段。而分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,大大促進(jìn)了斑潛蠅種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究。

Morgan首先采用RAPD-PCR分別檢測(cè)了南美斑潛蠅和三葉斑潛蠅在加利福尼亞中部和南部?jī)傻乩矸N群間的差異,其中南美斑潛蠅的兩個(gè)地理種群經(jīng)RAPD分析有差異,但三葉斑潛蠅不同地理種群間無(wú)差異,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分析得出:南美斑潛蠅種群間變異主要?dú)w因于地理分布,而三葉斑潛蠅的種群間變異與寄主偏好性相關(guān)[3]。何麗萍等擴(kuò)增云南南美斑潛蠅的COⅡ基因序列發(fā)現(xiàn),云南不同地理種群無(wú)明顯差異,同時(shí)也比較了其與斯里蘭卡、以色列及印度尼西亞3個(gè)亞洲國(guó)家及厄瓜多爾、危地馬拉及美國(guó)3個(gè)美洲國(guó)家不同種群的親緣關(guān)系,分析結(jié)果認(rèn)為云南的南美斑潛蠅不同種群和美洲的不同種群親緣關(guān)系最近,進(jìn)而推論云南的南美斑潛蠅可能來(lái)自美洲[20]。杜予州、王莉萍等對(duì)國(guó)內(nèi)美洲斑潛蠅ITS1和β-tubulin序列進(jìn)行了分析,結(jié)果表明:國(guó)內(nèi)不同地理種群及寄主種群均有一定分化,但分化程度較低[22-25]。馮賢比較了分別來(lái)自亞洲、歐洲、美洲8個(gè)不同國(guó)家的三葉斑潛蠅的COⅠ序列差異,認(rèn)為不同國(guó)家和地區(qū)的三葉斑潛蠅種群之間目前無(wú)明顯分化[8]。而Scheffer利用COⅠ基因?qū)θ~斑潛蠅進(jìn)行了分析,認(rèn)為三葉斑潛蠅種內(nèi)已發(fā)生了高度分化,專食辣椒的三葉斑潛蠅可能形成了新的寄主宗甚至新種,而且不同種群的COⅠ高度多態(tài)性也表明了三葉斑潛蠅在定殖過(guò)程中經(jīng)歷了一個(gè)或多個(gè)瓶頸[9]。從以上結(jié)果可知,目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的南美斑潛蠅、美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅不同種群均無(wú)明顯分化,而國(guó)外已報(bào)道三葉斑潛蠅種內(nèi)不同寄主種群已高度分化形成新的寄主宗,來(lái)自亞洲、歐洲、美洲等地區(qū)8個(gè)國(guó)家的三葉斑潛蠅不同地理種群無(wú)明顯分化,而來(lái)自亞洲、美洲等地區(qū)7個(gè)國(guó)家的南美斑潛蠅種群出現(xiàn)一定程度的分化。

5 種間雜交分析

不同種類斑潛蠅在生態(tài)適應(yīng)性方面有明顯差異[25],種間雜交有可能結(jié)合兩種的優(yōu)勢(shì)而產(chǎn)生新的適應(yīng)性更強(qiáng)的種類,給防治帶來(lái)困難,所以監(jiān)測(cè)其種間雜交情況具有非常重要的意義。不同的分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地鑒別物種的種間雜交,但目前在斑潛蠅中的研究還處于起步階段,僅Sakamaki研究了美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅的雜交行為。結(jié)果表明雜交僅發(fā)生于美洲斑潛蠅雌蟲(chóng)和三葉斑潛蠅雄蟲(chóng),后代全為雌蟲(chóng),利用ITS序列和COⅠ序列分別對(duì)三葉斑潛蠅和美洲斑潛蠅雜交后代作了分析,后代同時(shí)具有美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅的分子特征,證明后代確實(shí)是雜交產(chǎn)生,而不是孤雌生殖的后代[26]。

6 展望

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于斑潛蠅DNA分子標(biāo)記應(yīng)用的研究主要集中在rDNA的ITS序列和mtDNA的COⅠ和COⅡ基因序列,由于很多種斑潛蠅屬于重要的世界檢疫性害蟲(chóng),這就要求對(duì)其分子鑒定必須快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便?，F(xiàn)在雖有一些研究工作得到了可區(qū)分近緣種的分子標(biāo)記,但缺乏普遍公認(rèn)的可同時(shí)鑒別多個(gè)近緣種的簡(jiǎn)便且有效的分子鑒定技術(shù)。近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的DNA條形碼技術(shù)被公認(rèn)為能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定,而且操作快速簡(jiǎn)便[27],DNA條形碼技術(shù)的關(guān)鍵是DNA條形碼的確立,可以通過(guò)遺傳多態(tài)性分析和比較基因組學(xué)的方法找到合適的DNA序列作為DNA條形碼用于斑潛蠅的分子鑒定。另外,對(duì)于斑潛蠅種間雜交、種群分化、起源及傳播途徑等方面的研究,可采用具有試驗(yàn)程序簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、遺傳信息量大等優(yōu)點(diǎn)的SSR標(biāo)記和ISSR標(biāo)記等技術(shù),獲得有關(guān)斑潛蠅入侵的來(lái)源、雜交和基因滲透、瓶頸效應(yīng)以及入侵因素、物種進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)生等等多方面信息[12-13]。在今后的研究中,可針對(duì)斑潛蠅研究的不同目標(biāo),借鑒其他入侵生物研究中的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn),采用高效的DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)斑潛蠅進(jìn)行更全面、更深入的研究,從分子水平為斑潛蠅研究提供有益的補(bǔ)充和佐證。

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App lications of molecular markers in Liriomyza

W ang Shuaiyu1,2, Lei Zhongren1, Dong Baoxin2, Ren Baozhen2, Lu Zengquan2
(1.State Key Laboratory for Biology o f Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100193,China;2.The General Station o f Plant Protection in Shandong,Ji’nan250100,China)

The leaf m iners are the main pest of farm and horticultural crops.A fter invading China,Liriomyza sa

tivae,L.huidobrensisandL.trifo liihad caused great losses in agricultural p roduction and export trade.It is very difficult to identify closely-related species and analyze the geographical distribution and genetic diversity o f populations only based on the morphological charac ters.Mo lecu lar m arkers have been imp roved rapidly in recent years,w hich are ef ficient in solving some essential issues in the identification of related species and genetic differentiation inLiriomyza.In this paper,the applications of m olecular m arker techniques in m olecular identification,geographic distribution,sp read pattern,population genetic variation and hybridization ofLiriomyzawere reviewed,and the application prospects are also discussed.

molecular m arker technique;Liriomyza; molecular identification; spread path; population genetic differen tiation

Q 969.464.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.001

2010-03-11

2010-03-30

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”)項(xiàng)目(2009CB119000);國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2006BAD08A 17,2006BAD08A08);國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(gw zj)

*通信作者E-mail:leizhr@sina.com