肝纖維化中星狀細(xì)胞促血管生成分子機(jī)制的研究

張 峰，魏東華，孔德松，張曉平，陸 茵，3，王愛云，3，陳文星，3，鄭仕中，3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210029;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江大慶 163319;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210046)

肝纖維化(hepatic fibrosis)是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后的組織修復(fù)反應(yīng)，若無有效治療將演變?yōu)楦斡不透伟８卫w維化病理過程中，肝內(nèi)細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)間發(fā)生復(fù)雜的相互作用，結(jié)締組織異常增生，引起肝小葉和肝臟血流的病理性改變以及假小葉和結(jié)節(jié)形成，破壞肝臟實質(zhì)與功能［1］。

現(xiàn)已明確，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化并轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(myofibroblast，MF)是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［2］。HSC是肝臟特有的周細(xì)胞，位于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelial cell，SEC)與肝細(xì)胞之間的Disse間隙內(nèi)，對肝臟微血管的結(jié)構(gòu)與功能具有重要調(diào)節(jié)作用［3］。近年來，隨著對肝纖維化病理機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)肝纖維化進(jìn)程與病理性血管生成之間關(guān)系密切，特別是活化型HSC可表達(dá)多種促血管生成因子旁分泌作用于SEC使其發(fā)生增殖與遷移，從而促進(jìn)血管新生并加速肝纖維化進(jìn)程。闡明HSC促進(jìn)肝纖維化病理性血管生成的分子機(jī)制已受到越來越多的關(guān)注，從中有可能發(fā)現(xiàn)抗肝纖維化治療的新靶標(biāo)。

1 肝纖維化進(jìn)程中的病理性血管生成

血管生成(angiogenesis)是指經(jīng)多種因子的作用，在原有血管結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上生長出新毛細(xì)血管的生物學(xué)過程，缺氧是血管生成的主要刺激因素。肝纖維化中細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積使得肝小葉下靜脈、小葉中央靜脈及肝靜脈竇受壓，導(dǎo)致肝靜脈壓力和門靜脈血管阻力均增高。當(dāng)門靜脈阻力的增加超出機(jī)體代償能力時，門靜脈血流速度及血流量降低，肝臟血氧供應(yīng)減少從而形成缺氧［4］。Rosmorduc等［5］利用膽道結(jié)扎致大鼠肝纖維化模型首次報道了肝纖維化與血管生成之間的關(guān)聯(lián)。此后諸多研究者利用二乙基亞硝胺、CCl4以及膽堿缺乏的氨基酸飼料喂養(yǎng)等因素所致鼠類肝纖維化模型進(jìn)行體內(nèi)、外的實驗研究，均發(fā)現(xiàn)纖維化致缺氧條件下的病理性血管新生現(xiàn)象十分明顯，肝組織內(nèi)多種促血管生成因子表達(dá)明顯增加［6-8］。

然而肝纖維化區(qū)域的新生血管紊亂，多數(shù)為未成熟的無效血管，并不能改善局部的組織缺氧狀態(tài);此外，血管新生導(dǎo)致再生肝細(xì)胞周圍形成血管叢和分流，阻礙血竇和肝細(xì)胞間的物質(zhì)交換，再生肝細(xì)胞不能建立正常的門脈分支，進(jìn)而加劇肝細(xì)胞損傷［9］。因此，肝纖維化與血管新生之間形成惡性循環(huán)，血管生成增加而纖維化不退反進(jìn)，嚴(yán)重阻礙了肝纖維化的逆轉(zhuǎn)與恢復(fù)。

2 肝星狀細(xì)胞表達(dá)的促血管生成關(guān)鍵因子

2.1缺氧誘導(dǎo)因子缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)是一種受細(xì)胞內(nèi)氧濃度調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子。缺氧條件下，HIF-1α穩(wěn)定性增加并迅速活化，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與目的基因啟動子或增強(qiáng)子上的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄過程［10］。目前已明確HIF-1α可直接激活多種促進(jìn)血管生成因子的基因表達(dá)。

2.2血管內(nèi)皮生長因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是HIF-1α激活的一個主要的促血管生成因子。VEGF可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，降解毛細(xì)血管基底膜從而有利于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和趨化;VEGF通過與其受體VEGFR-2結(jié)合，以蛋白激酶C途徑(不依賴于Ras)激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖［11］。VEGF是肝臟病理性血管生成的重要啟動因子之一，在與血管外基質(zhì)降解和SEC形態(tài)學(xué)改變相關(guān)的血管生成早期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.3Notch受體Notch受體(Notch1-4)和Notch配體(Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3 和 Delta4)是跨膜受體蛋白家族成員，與其胞內(nèi)效應(yīng)分子共同組成Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對血管發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)有重要調(diào)控功能。Notch受體通過與其配體結(jié)合啟動Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，不需第二信使和蛋白激酶的參與就可直接將鄰近細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)，進(jìn)而激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。目前已發(fā)現(xiàn)，肝臟中各種類型的細(xì)胞均能表達(dá)Notch 受體與相關(guān)因子［12］。

2.4血小板衍生生長因子血小板衍生生長因子(PDGF)由二硫鍵連接的同源二聚體或異源二聚體組成，其受體(PDGF-βR)屬受體酪氨酸激酶家族。PDGF受體結(jié)合配體后，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域酪氨酸殘基自身磷酸化將信號傳入胞內(nèi)，進(jìn)而激活下游級聯(lián)反應(yīng)。PDGF是一有效的血管生成趨化因子，對周細(xì)胞募集有促進(jìn)作用。在肝臟血管生成中，SEC分泌的PDGF能夠誘導(dǎo)并募集表達(dá)其受體的HSC至新生血管周圍，使其穩(wěn)定成熟從而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂姓９δ艿难埽?3］。

2.5促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體(Eph受體)及其配體Ephrin均是細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶，根據(jù)序列保守性和它們的親和力不同均分為A、B兩個亞類。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)9種EphA受體(EphA1-A9)、6種EphrinA配體(EphrinA1-A6)、6種EphB受體(EphB1-B6)和3種EphrinB配體(EphrinB1-B3)。Eph受體與Ephrin配體均可發(fā)生磷酸化從而介導(dǎo)雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，即配體也具有受體樣功能，接受受體刺激后產(chǎn)生反向信號傳遞調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)［14］。肝纖維化中，Ephrin配體與Eph受體是HSC促進(jìn)血管生成以及與SEC進(jìn)行信號交流的重要調(diào)控因子。

2.6瘦素瘦素(leptin)是Ob基因的編碼產(chǎn)物，主要通過與細(xì)胞表面的功能性受體ObRb結(jié)合，經(jīng)Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)途徑發(fā)揮生物學(xué)作用。瘦素結(jié)合ObRb后引起JAK1、JAK2及受體胞質(zhì)區(qū)磷酸化，進(jìn)而下游蛋白STAT磷酸化并轉(zhuǎn)至核內(nèi)調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá);瘦素還可通過ERK1/2和PI3K依賴性的機(jī)制穩(wěn)定HIF-1α，促進(jìn)其轉(zhuǎn)移至核內(nèi)從而啟動缺氧誘導(dǎo)的血管生成過程［15］。

2.7Hedgehog蛋白Hedgehog蛋白(Hh)為疏水性分泌型蛋白，其介導(dǎo)的信號通路主要由Hh配體、跨膜受體Ptch和Smo及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli級聯(lián)構(gòu)成。當(dāng)Hh配體缺失時，Ptch抑制Smo的活性，Hh通路處于失活狀態(tài);當(dāng)Hh配體存在時，與Ptch結(jié)合從而解除對Smo的抑制，Gli繼而從微管解離并轉(zhuǎn)入核內(nèi)誘導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄;胞內(nèi)Gli的表達(dá)水平可反映Hh通路的活化狀態(tài)。Hh通路可通過Rho激酶依賴性機(jī)制促進(jìn)血管腔形成;還可經(jīng)iNOS/Netrin/PKC途徑上調(diào)VEGF 的表達(dá)［16］。

2.8血管生成素-1血管生成素(angiopoietin，Ang)-1是另一特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子。血管周細(xì)胞分泌的Ang-1與其內(nèi)皮細(xì)胞上的Tie-2受體特異性結(jié)合后促使其磷酸化，通過下游Akt/Survinin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及通過PI3K/FAK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑募集周細(xì)胞至新生血管壁，促進(jìn)血管成熟與穩(wěn)定;Ang-1也是內(nèi)皮生存因子，可以抑制VEGF以及炎癥因子引起的血漿滲漏［17］。

3 肝星狀細(xì)胞促進(jìn)血管生成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

3.1VEGF-Notch信號途徑Ankoma-Sey等［18］利用 CCl4致大鼠肝纖維化模型首次證實了活化的HSC能時間依賴性地高表達(dá)VEGF，并伴有其受體VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)上調(diào);平行進(jìn)行的體外實驗也發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的大鼠HSC在活化過程中VEGF表達(dá)逐漸升高。缺氧還可誘導(dǎo)大鼠HSC表達(dá)環(huán)氧合酶(COX)-2，進(jìn)而激活HIF-1α，增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)其釋放［19］。在d-半乳糖胺和脂多糖致小鼠肝損傷中，VEGFR-2通路的激活可抑制化學(xué)物質(zhì)對SEC的細(xì)胞毒作用并減少其凋亡，在肝損傷血管生成中可能起主要作用［20］;給CCl4致肝纖維化小鼠單獨或聯(lián)合服用VEGFR-1和VEGFR-2抗體可明顯抑制肝臟血管生成并減輕纖維化病變程度，并且VEGFR-2抗體要比 VEGFR-1抗體更有效［7］，這進(jìn)一步表明在肝纖維化血管生成中VEGF與VEGFR-2的相互作用是主要的。人HSC在缺氧應(yīng)答時VEGF受體表達(dá)情況與大鼠不同，人HSC中VEGF的兩個主要受體VEGFR-1和2均上調(diào)，而在大鼠HSC中主要是VEGFR-1上調(diào)［21］。此外，缺氧時VEGF可誘導(dǎo)HSC表達(dá)Notch配體Dll4，與SEC膜上相應(yīng)Notch受體結(jié)合后促使其作出血管生成應(yīng)答［22］。在病理狀態(tài)下，SEC內(nèi)Notch-3受體和Dll4的表達(dá)也均上調(diào)［23］。K?hler等［24］發(fā)現(xiàn) Notch 配體 Jagged-1 激活 Notch 受體可促進(jìn)2/3肝移植后的組織與血管再生，并刺激SEC的生長和分化。

3.2PDGF-Ephrin信號途徑PDGF可使HSC獲得促血管生成表型，即募集HSC至肝竇并增加其在肝竇內(nèi)的分布，從而改變肝臟微血管的通透性與壓力。應(yīng)用受體酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼(sunitinib)阻斷PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)則可減少CCl4致大鼠肝竇血管新生，降低肝臟血管密度和門靜脈壓力并減輕肝纖維化病變，包括減少 α-平滑肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)、膠原沉積和炎性滲透［25］。另一能夠阻斷PDGF信號通路的索拉非尼(sorafenib)對大鼠實驗性門靜脈高壓和肝纖維化也有療效。索拉非尼通過阻斷PDGF-βR以及Raf/MEK/ERK等促血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑減少門體循環(huán)側(cè)支血管的生成，抑制門靜脈高壓引起的肝臟血管新生與重構(gòu)，從而緩解纖維化引起的組織損傷［26］。近年來發(fā)現(xiàn)，PDGF誘導(dǎo)肝竇血管生成的作用依賴于Ephrin-B2介導(dǎo)的信號途徑，HSC內(nèi)PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以上調(diào)Ephrin-B2的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，分泌至細(xì)胞膜上再作用于相鄰HSC膜上的Eph-B4受體，依次通過ERK通路和轉(zhuǎn)錄因子KLF2等級聯(lián)過程，促進(jìn)HSC向ESC的遷移與肝竇微血管的發(fā)生與重構(gòu)［27-28］。

3.3Leptin-Hedgehog信號途徑瘦素能增加人HSC中許多缺氧誘導(dǎo)的因子特別是VEGF的表達(dá)，且ObRb、VEGF、α-SMA在纖維化肝臟中共同高表達(dá)，這也表明瘦素與肝纖維化血管新生之間存在密切關(guān)聯(lián)［29］。Kitade等［8］以膽堿缺乏的氨基酸飼料喂養(yǎng)天然缺失ObR的Zucker大鼠，發(fā)現(xiàn)其不發(fā)生肝纖維化，而其子代(能正常表達(dá)ObR)則發(fā)生肝纖維化甚至肝硬化，并且纖維化小結(jié)周圍血管出現(xiàn)明顯的病理性重構(gòu)，這進(jìn)一步表明瘦素及其信號系統(tǒng)對肝纖維化中的血管新生與重構(gòu)起促進(jìn)作用。新近發(fā)現(xiàn)［30］，HSC可表達(dá)Hh配體和Hh通路的多種因子，且Hh信號系統(tǒng)處在瘦素介導(dǎo)的PI3K/Akt通路的下游。肝纖維化中，活化的HSC釋放含有Hh配體的活性微粒，作用于SEC后改變其相關(guān)因子的基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝竇微血管新生與重構(gòu)［31］。Choi等［32］最近報道，HSC釋放的Hh配體激活Hh通路后可誘導(dǎo)SEC產(chǎn)生血管生成應(yīng)答，并促進(jìn)HSC發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，加劇肝竇病理性重構(gòu)。

3.4Ang-1/Tie-2信號途徑在正常氧濃度下體外活化的HSC可以表達(dá)Ang-1，而缺氧時Ang-1及其特異性受體Tie-2均明顯上調(diào)［21］。體內(nèi)研究顯示，Ang-1/Tie-2受體系統(tǒng)在部分肝切除后肝竇重建以及肝壞死區(qū)域肝竇毛細(xì)血管化的發(fā)展中起重要作用，且在CCl4致肝損傷大鼠的肝組織中Ang-1的基因表達(dá)增加［33］。在小鼠膽道結(jié)扎致肝纖維化中，免疫組化結(jié)果也顯示活化的HSC高表達(dá)Ang-1;而給予重組腺病毒表達(dá)可溶性Tie-2受體蛋白則抑制了血管生成和纖維化程度［34］，因為該重組蛋白可以阻止SEC上Tie-2受體酪氨酸激酶的磷酸化即阻斷Ang-1/Tie-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。臨床慢性丙型肝炎并肝纖維化病人的肝臟活檢組織中也檢測到肌成纖維樣細(xì)胞高表達(dá) VEGF、Ang-1、Tie-2等血管生成相關(guān)因子［35］。在肝纖維化慢性炎癥環(huán)境中，HSC和SEC之間的Ang-1/Tie-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)了HSC或MF的非定向遷移和趨化，加速了病理性血管生成的發(fā)展。

4 總結(jié)與展望

肝纖維化程度與組織微血管形態(tài)改變平行，血管生成既是慢性肝損傷后組織修復(fù)中血管重塑的表現(xiàn)，也與纖維化進(jìn)程及并發(fā)癥關(guān)系密切。HSC通過表達(dá)多種促血管生成因子以及相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)了病理性血管生成，其中的分子調(diào)控機(jī)制是抗血管生成藥物干預(yù)肝纖維化的潛在靶標(biāo)。

已報道的抗血管生成療法治療實驗性肝纖維化的研究表明，抑制血管生成信號系統(tǒng)可以阻遏肝纖維化進(jìn)程，顯現(xiàn)較好的療效和前景，但對于以下幾點尚需深入研究:(1)調(diào)控肝纖維化血管生成的分子機(jī)制眾多，其中VEGF和PDGF是較主要的兩條，分別在血管發(fā)生與穩(wěn)定階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。在對腫瘤的抗血管生成治療中發(fā)現(xiàn)，單一抑制VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的長期療效不佳，且易產(chǎn)生腫瘤耐藥，而在雙重阻斷VEGF和PDGF后療效明顯改善［36］。因此以抑制血管生成來抗肝纖維化的有效治療也應(yīng)是多途徑和多靶標(biāo)的;(2)血管生成對于肝組織的損傷恢復(fù)也是必需的，因此在拮抗病理性血管生成的同時應(yīng)能夠控制抑制程度，以防過度抑制肝臟恢復(fù)與再生所需的生理性血管生成;(3)血管生成抑制劑的抗肝纖維化作用研究目前僅限在動物實驗中，將其成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用尚需更加深入全面的生理病理及藥物作用機(jī)制研究。

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