牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法研究進(jìn)展

張鑫瀟，謝巖黎，王金水，嚴(yán)瑞東

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州450052）

牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法研究進(jìn)展

張鑫瀟，謝巖黎，王金水，嚴(yán)瑞東

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州450052）

β-內(nèi)酰胺酶可以水解生鮮奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素，使檢測方法無法正確判斷其是否為“無抗奶”，掩蓋抗生素超標(biāo)的事實(shí)。對(duì)牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)、殘留的現(xiàn)狀和危害、檢測方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

β-內(nèi)酰胺酶；生鮮奶；檢測方法

0 引言

奶制品中抗生素殘留的問題是牛奶及其制品質(zhì)量安全中的重點(diǎn)問題。有關(guān)抗生素殘留的檢測方法日趨完善，但是一些不法分子為了逃避抗生素的檢測，向牛奶內(nèi)添加β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase），可以使β-內(nèi)酰胺類抗生素如常用的青霉素降解，使微生物法、酶聯(lián)免疫法等常規(guī)的檢測方法失效，從而無法正確判斷是否為“無抗奶”，掩蓋抗生素超標(biāo)的事實(shí)。

2009年2月4 日，根據(jù)衛(wèi)生部等九個(gè)部門《關(guān)于開展全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治的緊急通知》的規(guī)定，為配合全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治工作的深入開展，專項(xiàng)專家委員會(huì)提出《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第二批）》，其中就包括β-內(nèi)酰胺酶。

1 牛乳中β-內(nèi)酰胺酶潛在危害及殘留現(xiàn)狀

β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌產(chǎn)生的一種能水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶。已發(fā)現(xiàn)二百多種β-內(nèi)酰胺酶。其中比較有代表性的青霉素酶，即能催化水解青霉素β-內(nèi)酰環(huán)產(chǎn)生青霉噻唑酸的一類β-內(nèi)酰胺酶。青霉素酶根據(jù)Bush-Jacoby-Medeiros最新分類法[1]，以底物譜和抑制劑不同可分為四組，按各自氨基酸和核苷酸序列屬于A、B、C、D四類。第一組為頭孢菌素酶（AmpC酶），不被克拉維酸抑制，分子類別屬于C類，本組酶大部分由染色體介導(dǎo)，也可由質(zhì)粒介導(dǎo)[2-5]；第二組β-內(nèi)酰胺酶數(shù)目最多，如青霉素酶和超廣譜酶，可被克拉維酸抑制，多由質(zhì)粒介導(dǎo)，其中除碳青霉烯類水解活性分屬2 d亞組為D類，其他皆為A類；第三組為金屬β-內(nèi)酰胺酶，分子類別為B類，不被克拉維酸抑制，但可被EDTA抑制；第四組為其它不能被克拉維酸完全抑制的青霉素酶，分子類別未定[6]?，F(xiàn)今已分離出多種類型的青霉素酶，白色粉末狀，分子量50 ku，溶于水，酶溶液易失活，酶反應(yīng)最適pH值為6.0～6.5，以青霉素G鉀鹽為底物，酶促中反應(yīng)速率為半最大值時(shí)，底物濃度為4.32×10-3mol/L（5/B酶），4.89×10-3mol/L（569酶）。醫(yī)療上用于青霉素過敏癥的治療，在實(shí)驗(yàn)中青霉素酶用于破壞或抑制青霉素活性。

在β-內(nèi)酰胺類抗生素大量存在的環(huán)境中，有些微生物可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶[7]，催化β-內(nèi)酰胺開環(huán)降解，使抗生素水解失活[8]。因此，細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性，主要是細(xì)菌在接觸藥物后，通過質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)發(fā)生基因突變產(chǎn)生的[9]。但是由此產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶含量很低，在不人為添加β-內(nèi)酰胺酶的條件下是無法檢測到微生物產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶的。究其原因可能是由于采奶方式、牛奶的組分、消毒方法和包裝儲(chǔ)存方法等不適于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶微生物的生存，基于目前科研的認(rèn)識(shí)和實(shí)踐，牛奶中檢出的β-內(nèi)酰胺酶是人為添加[10]。

有觀點(diǎn)認(rèn)為，正是假“無抗奶”的存在催生了國家嚴(yán)禁“無抗奶”標(biāo)識(shí)政策的出臺(tái)。β-內(nèi)酰胺酶的使用會(huì)助長牛奶生產(chǎn)中β-內(nèi)酰胺類抗生素的濫用，然而β-內(nèi)酰胺酶殘留危害如何如今還未定論。

β-內(nèi)酰胺類抗生素以青霉素為例，青霉素的過敏反應(yīng)非常普遍，約0.7～10%的患者對(duì)青霉素過敏，占過敏病人的74%。過敏反應(yīng)是青霉素中所含的一些雜質(zhì)引起的，引起過敏反應(yīng)的基本物質(zhì)有兩種，一種是青霉素裂解生成一些青霉噻唑酸，與蛋白質(zhì)結(jié)合形成抗原而致敏。另一種過敏源是一些高聚物，為β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)后自身聚合而成，聚合程度越高，過敏反應(yīng)越強(qiáng)。而青霉素在β-內(nèi)酰胺酶作用下，酶中親核性基團(tuán)向β-內(nèi)酰胺環(huán)進(jìn)攻，開環(huán)后可脫羧重排生成中間體青霉噻唑酸[11，12]。雖然由于添加β-內(nèi)酰胺酶造成青霉素過敏的病例并未被研究證明，但根據(jù)青霉素的過敏機(jī)理，以及β-內(nèi)酰胺酶的添加可能會(huì)造成β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的原因，確實(shí)應(yīng)該對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的濫加提高警惕，嚴(yán)加管理。

由于抗生素殘留的普遍性，而國家又明文規(guī)定了抗生素殘留不能超量，“無抗”又成為乳制品的重要質(zhì)量指標(biāo)，因此出于逃避檢測等各種目的，假“無抗奶”的出現(xiàn)令人擔(dān)憂[13]。中國藥品生物制品檢定所的崔生輝等人在2006年對(duì)從零售市場上隨機(jī)采集的5個(gè)廠家生產(chǎn)的38份牛奶樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果38份市售牛奶樣品63.2%(24/38)檢出β-內(nèi)酰胺酶[14]。由此可見β-內(nèi)酰胺酶的濫用情況非常普遍。

2 β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法

2.1 微生物法

用微生物法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶檢測，最先是在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室為了了解細(xì)菌的耐藥機(jī)制及指導(dǎo)臨床合理使用抗生素、延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生、控制耐藥菌株的播散和流行以及研究、開發(fā)新型、穩(wěn)定和高效的抗生素，采用了多種微生物法對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐藥菌株進(jìn)行密切監(jiān)測[15]，主要方法有：顯色培養(yǎng)基法[16]、三維試驗(yàn)法[17]、紙皮擴(kuò)散確認(rèn)法[18]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法[19]等。

2007年中國藥品生物制品檢定所的崔生輝等人通過青霉素分解實(shí)驗(yàn)和蛋白電泳實(shí)驗(yàn)分析“生鮮牛乳抗生素分解劑”的有效成分，結(jié)果證實(shí)β-內(nèi)酰胺為其主要的成分。然后運(yùn)用β-內(nèi)酰胺酶特異性抑制劑舒巴坦建立了該酶的檢測方法。該方法在牛奶中的檢出限為4 U/mL β-內(nèi)酰胺酶[14]。其所用的方法主要是運(yùn)用微生物培養(yǎng)法，基本原理是利用克拉維酸、舒巴坦的特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的特點(diǎn)做細(xì)菌培養(yǎng)，通過測量抑菌圈得出結(jié)果。該方法可以檢測出牛奶中未反應(yīng)完全（未失活）的β-內(nèi)酰胺酶，可用于檢測未經(jīng)過任何加工的牛奶。檢出限較低。北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司開發(fā)的ZY-400系列β-內(nèi)酰胺酶測量分析儀也是根據(jù)微生物培養(yǎng)法的原理檢測乳與乳制品中的舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)。

2.2 碘量法

碘量法是氧化還原滴定法中，應(yīng)用比較廣泛的一種方法。β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素的結(jié)構(gòu)活性中心,其性質(zhì)活潑,是分子結(jié)構(gòu)中最不穩(wěn)定的部分,其穩(wěn)定性與含水量和純度有很大關(guān)系，β-內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定是因?yàn)椋h(huán)張力大和內(nèi)酰胺鍵易水解[19]。利用青霉素分子不消耗碘,而其降解產(chǎn)物青霉噻唑酸消耗碘的性質(zhì),采用碘量法測定。

Sykes和Nordstrom用碘量法檢測β-內(nèi)酰胺酶的活性，脫色反應(yīng)緩慢，青霉素需反應(yīng)徹底，15～20 min后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并檢測該反應(yīng)過程的吸光率變化，該實(shí)驗(yàn)的檢測限可以達(dá)到0.001 U[20，21]。南昌大學(xué)的薛哲等人在對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)熱的穩(wěn)定性的研究中，利用青霉素或頭孢菌素不消耗碘，而其降解產(chǎn)物消耗碘的性質(zhì)，采用剩余碘量法測定，以標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法計(jì)算含量[22]。

北京六角體科技發(fā)展有限公司β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試劑盒原理為牛奶中的β-內(nèi)酰胺酶與試劑反應(yīng)后產(chǎn)生的水解物，再與鑒別試劑反應(yīng)，觀察是否生成藍(lán)色物質(zhì)，可以鑒別牛奶中是否含有β-內(nèi)酰胺酶，只適用于生鮮奶，檢測下限為50 U/mL以上（酶活性）。

碘量法可檢出牛奶中已反應(yīng)及未反應(yīng)的β-內(nèi)酰胺酶，可用于檢測鮮奶及奶制品中的β-內(nèi)酰胺酶，檢出限較高。

2.3 酸測定法

是根據(jù)青霉素或頭抱菌素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶作用產(chǎn)生裂解酸引起pH值變化,使指示劑色變或碳酸鈉溶液釋放出二氧化碳的壓力變化及以堿滴定來設(shè)計(jì)的。

Richard J.Henry和Riley D.Housewright[23]早在1946年的時(shí)候利用壓力測量計(jì)，根據(jù)青霉素酶分解青霉素產(chǎn)生中間產(chǎn)物青霉酸，然后分解得二氧化碳和青霉噻唑酸的原理，測得二氧化碳的變化量計(jì)算β-內(nèi)酰胺酶的含量。

在醫(yī)學(xué)和獸藥研究方面，酸測定法應(yīng)用于對(duì)阿莫西林、氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌株的檢測。張春輝、張曉根與胡功政以酚紅為指示劑，用酸測定法對(duì)耐藥菌株檢測，陽性率為97%[24]。

首都師范大學(xué)化學(xué)系的馬潔與李孝君等人，根據(jù)酸測定法原理，利用酸度計(jì)檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的殘留量。該方法在磷酸緩沖液和牛奶中，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢出限分別為10 U/mL和15 U/mL，同時(shí)得到的米系常數(shù)為0.0351 mmol/L[25]。

2.4 液相、氣相法檢測

衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第二批）》中包括β-內(nèi)酰胺酶，其檢測方法是由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院食品安全所提供，推薦使用液相色譜法。

在β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)過程中，需對(duì)副產(chǎn)物青霉噻唑酸加以控制，利用高效液相色譜法可以直接檢測重組菌中是否含有青霉素酶。中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的趙靜枚、都絳瑛與張銘俊利用高效液相色譜法對(duì)青霉噻唑酸進(jìn)行了液相色譜的定性檢測，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確[26]。

農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心的韓奕奕與王建軍等人，用加標(biāo)的方法制備含不同濃度β-內(nèi)酰胺酶的還原乳，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法按國標(biāo)GB/T22388-2008操作。用SNAP雙流向酶聯(lián)免疫間接檢測法對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測限可以達(dá)到0.0005 U/mL和0.001 U/mL。此法可以作為快速檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的快快速篩選方法，有較高的精確度和靈敏度[27]。

3 β-內(nèi)酰胺酶檢測的研究現(xiàn)狀及展望

β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法有微生物法、分光光度法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法等。微生物法周期長，分光光度比色法易受干擾，酸測定法中，根據(jù)壓力變化測定的檢測法費(fèi)時(shí)冗長、操作較繁,影響因素多,又需特殊設(shè)備,很少使用。而利用pH值變化測定的檢測法則簡單易行,重復(fù)性較好,最易獲取結(jié)果,且較靈敏,穩(wěn)定性好,但也存在假陽性和假陰性的問題，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，特別是基層檢測。液相色譜和氣相色譜法是國標(biāo)，具有檢測精度高,檢測限低，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在樣品前處理步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)、檢測儀器昂貴、周期長、成本高，且依賴專業(yè)技術(shù)人員等問題，不利于基層質(zhì)檢部門作為大面積初篩、不利于現(xiàn)場快速檢測和監(jiān)督，也不利于指導(dǎo)消費(fèi)者家庭內(nèi)對(duì)牛奶的選擇性識(shí)別。建立一種簡便、快速、高效、成本低廉β-內(nèi)酰胺酶試紙檢測技術(shù)具有重要意義。

[1] BUSH K,JACOBY G A,MEDEIROS A A.A Functional Classification Scheme for β-lactamases and Its Correlation with Molecular Structure[J].Antimicrob Agents Chemother,1995,39:1211.

[2] GNIADKOWSKI M,SCHNEIDER I,JUNGWIRTH R,et al.Ceftazidime Resistant Enterobacteriaceae Isolates from Three Polish Hospitals:Identification of Three Novel TEM-and SHV-5-type Extendspectrum β-lactamases[J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42:514.

[3] STAPLETON P D,SHANNON K P,FRENCH G L.Construction and Characterization of Mutants of the TEM-1β-lactamase Containing Amino Acid Substiutions Associated with both Extended-Spectrum Resistance and Resistance to β-lactamase Inhibitors[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43:1881.

[4] LEFLON-GUIBOOUT V,SPELDOOREN V,HEYM B,et al.Epidemiological Survey of Amoxicillin-Clavulanate Resistance and Corresponding Molecular Mechanisms in Escherichia Coli Isolates in France:new Genetic Features of bla TEM genes[J].Antimicrob Agents Chemother,2000:2709.

[5] DE CHAMPS C,MONNE C,BONNT R,et al.New TEM Variant(TEM-92)Produed by Proteus Mirabilis and Providencia Stuartii Isolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45:1278.

[6] KATSUNO S,TAKASHI M,OHSHIMA S,et al.Direct Screening of the Imp-1 Metallo-beta-lactamase Gene(blaIMP)from Urine Samples by Polymerase Chain Reaction[J].Int Jurol,2001,8:110.

[7] SAMAHA-KFOURY,ARAJ J N G F.Recent Developments in beta Lactamases and Extended Spectrum beta Lactamases[J].Bmj,2003,327(7425):1201-1213.

[8] NEU H C.The Crisisin Antibioticrsistance[J].Science,1992,257:1064-1073.

[9] COLRMAN K,ATHALYE N,CLENCEY A,et al,Bacterial Resistance Mechanisms as Therapeutic Target[J].Antimicrob Chemther,1994,33:1091-1116.

[10] 劉琴.我國牛奶中抗生素殘留現(xiàn)狀分析及對(duì)策[J].當(dāng)代畜牧,2005（6）：1-2.

[11] 郭宗儒.藥物化學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2005:441-445.

[12] 彭司勛.藥物化學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1986：312-314.

[13] 鄭穎.TEM_116型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對(duì)牛奶中抗生素的清除[J].中國抗生素雜志,2008,33(2):122-124.

[14] 崔生輝，李景云，馬越，等.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2007,19(12)：113-116.

[15] 孟峻，郭素芳.革蘭氏陰性桿菌AmpC_內(nèi)酰胺酶的檢測及其意義[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009,31(3):198-200.

[16] 周愛春.ESBLs顯色培養(yǎng)基的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2009,6(5):49-50.

[17] 王寅，趙虎.醫(yī)院感染病原菌AmpC與超光譜_內(nèi)酰胺酶檢測[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志[J].2009,19(11)：1425-1427.

[18] 李蓉，趙林.紙片擴(kuò)散確認(rèn)法與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測超廣譜_內(nèi)酰胺酶的比較[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2009,30(2):219-223.

[19] 葉紅,潘玲麗.頭孢類抗菌素在輸液中的作用[J].中國藥師,2006,9(11):1069-1071.

[20] SYKES R B，NORDSTROM K.Microiodometric Determination of β-Lactamase Activity[J].American Society for Microbiology,1972,1(2):94-99.

[21] NOVICK R P.Microiodometric Assay for Penicillinase[J].Biochem，1962,83:236-240.

[22] 薛哲，李剛.β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)熱的穩(wěn)定性的研究[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,48(4):42-46.

[23] HENRY R J,HOUSEWRIGHT R D.Studies on Penicillinase and Penicillin.Ⅱ.Manometric Methods of Assaying Penicillinase Reaction and the Effects of Inhibitors on Penicillinase[J].Biol.Chem.，1947,167:559-565.

[24] 張春輝,張曉根,胡功政.豬雞常見致病菌β-內(nèi)酰胺酶的檢測[J].鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2005,25（2）：81-83.

[25] 馬潔，李孝君.利用酸度計(jì)檢測奶制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶[J].化學(xué)通報(bào),2009(4):370-373.

[26] 趙靜枚，都絳瑛，張銘俊.青霉素裂解液的高效液相色譜分析[J].色譜，2001，19（1）：88-89.

[27] 韓奕奕，王建軍.牛奶中三聚氰胺和β-內(nèi)酰胺酶快速檢測方法的評(píng)估—雙流向酶聯(lián)免疫法[J].中國奶牛,2009(6):46-48.

Research on analytical methods of β-lactamase residue in milk

ZHANG Xin-xiao，XIE Yan-li，WANG Jin-shui，YAN Rui-dong
(School of Food Science and Technology Henan University of Technology,Zhengzhou 450052，China)

β-lactamase can hydrolyze β-lactam antibiotics,which cause failure analysis of antibiotics.Then we can't estimate which is antibiotic-free milk.This paper reviews the construction,current residue situation,hazard and the methods of identification.

β-lactamase；Raw milk；Analytical methods

TS252.7

B

1001-2230（2011）02-0045-03

2010-05-24

張鑫瀟（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。