Caspase-3和JNK與腦缺血再灌注后細胞凋亡的關(guān)系

張 霞 高維娟 朱炎杰 (承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

缺血性腦血管病是目前神經(jīng)內(nèi)科最常見的一種疾病，占全部腦血管疾病的43% ～65%，嚴重威脅人類生命健康，其致殘率非常高。對這種疾病的治療一般是以疏通堵塞的血管改善病變部位的血液供應(yīng)為主，而當缺血部位的血液供應(yīng)好轉(zhuǎn)以后就容易發(fā)生更加嚴重的再灌注損傷，其中細胞凋亡發(fā)揮著重要的作用。再灌注損傷的發(fā)生機制非常的復(fù)雜?，F(xiàn)就Caspase-3和JNK與腦缺血再灌注后細胞凋亡關(guān)系綜述如下。

1 Caspase-3與腦缺血再灌注損傷

1.1 Caspase-3在腦缺血再灌注損傷中的作用 腦缺血/再灌注損傷是一種常見的、復(fù)雜的病理生理過程。有研究表明〔1〕，腦缺血后隨著再灌注時間的延長，缺血側(cè)皮層凋亡細胞數(shù)量明顯增加，主要分布在梗死灶邊緣區(qū)，48 h凋亡細胞達到高峰，說明凋亡在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用。凋亡需要細胞內(nèi)一些基因的調(diào)控和能量的消耗，涉及多種蛋白的參與。以細胞核濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段、細胞縮小、最終形成凋亡小體等形態(tài)變化為特征。

目前一些學者認為，腦缺血后神經(jīng)細胞的凋亡過程主要通過天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶(caspase)依賴途徑和非caspase依賴途徑實現(xiàn)的，而Caspase-3是caspase依賴途徑中起關(guān)鍵作用的物質(zhì)。其中Caspase-3蛋白是缺血后介導神經(jīng)細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶〔2〕。Tominaga等〔3〕首次證實缺血性腦損傷可引起神經(jīng)細胞凋亡，近年來許多學者從形態(tài)學、分子生物學等方面研究證實，細胞凋亡參與腦缺血再灌注損傷。Ferrer等〔4〕報道健康成年大鼠大腦中動脈線拴法(MCAO)后，于缺血后再灌注1、4、6、12 h不同時間點，通過免疫組化方法觀察缺血腦組織中Caspase-3蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)缺血后再灌注1 h無Caspase-3激活，缺血后再灌注4 h Caspase-3表達增加，缺血后再灌注6、12 h表達繼續(xù)增加，與細胞凋亡趨勢相同，說明了Caspase參與了腦缺血再灌注后損傷。Le等〔5〕發(fā)現(xiàn)缺失Caspase-3基因的大鼠缺血2 h再灌注48 h皮層梗死體積減小55%，TUNEL陽性細胞密度減小36%，揭示了Caspase-3與腦缺血后神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。趙敏等〔6〕研究中，證實大鼠局灶性腦缺血及再灌注早期Caspase-3表達變化不明顯，再灌注6～48 h逐漸增高，在48 h達到高峰，與神經(jīng)元凋亡DNA裂解率表達時間分布一致。幾乎是在相同的時間，同樣提示Caspase-3參與了缺血后細胞凋亡過程，并起重要作用。應(yīng)用Caspase-3抑制劑可使缺血神經(jīng)元的損傷明顯減輕，也支持腦細胞缺血死亡涉及Caspase-3活性的觀點〔7〕。另有文獻報道，在缺血缺氧性腦損傷及腦缺血再灌注損傷中，應(yīng)用Caspase-3抑制劑可有效地減少腦缺血后神經(jīng)元凋亡的數(shù)量，從而起到腦保護作用〔8〕。以上研究結(jié)果說明Caspase-3參與了缺血性腦損傷，并在缺血神經(jīng)元的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

1.2 Caspase-3在腦缺血再灌注損傷中的作用機制 Caspases是正常細胞程序化死亡和損傷依賴性凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，在正常細胞作為一種基本成分表達，并與其抑制劑共存，以防意外激活而引起細胞損傷。是目前已知的凋亡最后執(zhí)行因子，凋亡的最后實施是通過Caspases的激活而實現(xiàn)的。Caspases的激活表現(xiàn)為“瀑布式”的級聯(lián)反應(yīng)，Caspase-3在細胞凋亡過程中居中心地位，是細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，在各種程序啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用〔9〕。它受多種因素的影響而激活，激活后的Caspase-3可以切割許多蛋白質(zhì)底物，包括Casepase的特異性底物多ADP核糖聚合酶(PARP)，細胞骨架蛋白(a-spectfin、B-spectrin、actin、tau蛋白等)、參與調(diào)節(jié)細胞骨架的蛋白gelsolin以及抗凋亡蛋白bcl-2等，使細胞內(nèi)一些參與DNA修復(fù)、mRNA剪切和DNA復(fù)制的酶失活或下調(diào)，從而使細胞喪失修復(fù)功能，穩(wěn)態(tài)不能正常維持〔10〕，不可逆的使細胞核濃縮，DNA斷裂，從而導致細胞凋亡〔7〕。

凋亡信號啟動后，Caspase-3可經(jīng)線粒體依賴途徑和細胞表面死亡受體(如TNFα-R1、FAS)途徑激活，在腦缺血再灌注損傷過程中，由Caspase依賴的線粒體凋亡通路已經(jīng)得到實驗研究的證實〔11，12〕，其中，細胞色素 C(CytC)和 Caspase-3 起著關(guān)鍵的作用。CytC是第一種被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白。在線粒體損傷后，CytC作為應(yīng)激傳感器被釋放到胞質(zhì)中，在ATP/dATP存在的情況下能與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和Caspase-9形成凋亡體，進而激活下游的 Caspase-3和Caspase-7，完成其相應(yīng)底物的剪切，引起細胞凋亡〔13〕。同時Caspase-3被認為是線粒體細胞凋亡途徑的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者〔14〕。

細胞受體途徑是另一重要的細胞凋亡途徑，其中Fas是此途徑主要的信號分子，F(xiàn)as與腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)〔15〕，是凋亡發(fā)生過程中重要的“死亡分子”〔16〕，一旦細胞表面表達Fas時，可與具有同源性死亡區(qū)的fas相關(guān)死亡區(qū)蛋白結(jié)合，后者再通過其死亡效應(yīng)區(qū)與Caspaae-8前體相結(jié)合從而激活Caspase-8，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終激活Caspase-3，導致細胞凋亡。

2 JNK與腦缺血再灌注后細胞凋亡

2.1 JNK在細胞凋亡過程中的作用 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，是信號從細胞表面轉(zhuǎn)導到細胞核內(nèi)部的重要傳遞者，在真核細胞中，已確定出4條MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，即細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路、C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路、P38通路及 ERK5通路〔17〕。JNK信號通路是MAPK中重要的通路，也是廣泛存在神經(jīng)細胞中的一條信號轉(zhuǎn)導途徑。JNK通路主要在促細胞凋亡中發(fā)揮作用。特別是缺氧，缺血再灌注等應(yīng)激情況，它的激活在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用〔18〕。

最近許多研究報道已經(jīng)證明神經(jīng)細胞缺血再灌注導致ERK、JNK、P38激活，ERK的激活保護神經(jīng)細胞免受缺血再灌注的損傷，而JNK、P38激活導致神經(jīng)細胞凋亡。Xia等〔19〕研究首次發(fā)現(xiàn)JNK在神經(jīng)元中的致凋亡作用，試驗通過去除小鼠PC-12嗜鉻細胞瘤中神經(jīng)生長因子，引起了持續(xù)的JNK和p38酶的激活及ERK的抑制，由JNK-p38和ERK的動態(tài)平衡決定細胞的存活或死亡。Okuno等〔20〕觀察到大腦中動脈線栓法(MCAO)后60min MCA區(qū)活化JNK增加，通過TUNEL染色及凋亡相關(guān)DNA片段分析，發(fā)現(xiàn)JNK選擇性抑制劑SP600125抑制了腦缺血誘導的神經(jīng)細胞凋亡，而且可以阻斷細胞凋亡因子Bax從胞漿轉(zhuǎn)入線粒體。說明了JNK的活化可以導致腦缺血后的神經(jīng)元凋亡。Herdegen〔21〕等結(jié)扎大鼠左大腦中動脈90 min致局灶性腦缺血后再灌注，發(fā)現(xiàn)梗死灶周圍組織可檢測到JNK活化的底物磷酸化C-Jun的高表達，于缺血再灌后72 h磷酸化C-Jun表達逐漸下降。同時，缺血側(cè)腦組織海馬、皮質(zhì)JNK活化伴有神經(jīng)元凋亡。Jiang等〔22〕采用大腦中動脈線栓法(MCAO)建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，用免疫組化法和免疫印跡法檢測ERK和JNK的活性，同時觀察缺血側(cè)腦組織凋亡細胞數(shù)。結(jié)果顯示缺血再灌注腦組織JNK蛋白的活性升高，凋亡細胞數(shù)增多。另有文獻表明〔23〕，敲除JNK3基因不僅減少了其下游c-Jun的磷酸化，而且保護了因腦缺血低氧導致的腦損傷;通過JNK3基因缺失小鼠研究證實，JNK3介導中樞神經(jīng)元的凋亡。JNK3的缺失在人腦腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要角色〔24〕。另外，鼠腦內(nèi)JNK3編碼基因的缺失可抵制外毒素的神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)元凋亡反應(yīng)障礙，進而證實了JNK在應(yīng)激誘導的神經(jīng)元致死效應(yīng)中的作用。以上資料表明JNK在腦缺血再灌注后細胞凋亡發(fā)揮著重要作用。

2.2 JNK信號通路的激活及其促凋亡的可能機制 JNK信號通路是由應(yīng)激引起的。研究證明MEKKl-JNKK-JNK通路在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導中起重要的作用。在各種應(yīng)激下，JNK分別由MAPKK類的JNK激酶1、2(即 MKK4、MKK7)激活，后者由不同的MAPKKK即MEKKI/2/3/4激活。JNK由 JNKl、JNK2和JNK3組成，JNKl，JNK2的表達具有廣泛性，JNK3局限于腦、心臟等組織。JNK包含雙磷酸化功能區(qū)Thr-Pro-Tyr，與c-JunN端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化。JNK的活化是通過其氨基酸殘基磷酸化，一旦被激活(稱為pJNK)，立即從胞漿中移位到細胞核作用其底物。目前已知JNK蛋白激酶的底物主要有3種轉(zhuǎn)錄因子:c-Jun、Elk-1、活化轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF-2)?；罨腃-Jun可以聚合成二聚體而形成可以活化的蛋白-1(AP-1)復(fù)合物，這種復(fù)合物通過與其靶DNA結(jié)合相結(jié)合激活下級基因而發(fā)揮其抗凋亡作用〔25〕。而JNK促進細胞凋亡的機制有二〔26〕:一方面，激活的JNK使c-Jun磷酸化，一起轉(zhuǎn)位到核內(nèi)。核內(nèi)JNK-c-jun/AP-1促進FasL的表達，導致細胞凋亡;另一方面，部分激活的JNK在胞漿中調(diào)節(jié)BcI-2家族成員(前凋亡蛋白Bax，Bid)，引起B(yǎng)ax轉(zhuǎn)位于線粒體，促進細胞色素釋放，激活caspase-3等，引起細胞凋亡。

實驗觀察到在腦缺血再灌注損傷中激活的JNK通路可調(diào)控凋亡相關(guān)基因家族成員的差異性表達:如Bad、Bax的表達上調(diào)和Bcl-2、Bcl-xl的表達下調(diào)。JNK也可通過激活胞漿中的Caspase家族、誘導Fas配體的表達、磷酸化p53和NF-kB等途徑導致細胞凋亡〔27〕。

3 JNK與caspase的相互關(guān)系

Guan等〔28〕在局灶性腦缺血再灌注的研究中發(fā)現(xiàn)，JNK激酶被激活后可能通過JNK介導的外源性和內(nèi)源性凋亡通路，而不僅是某個或某些蛋白或激酶的激活發(fā)揮作用。Chen等〔29〕在銅誘導神經(jīng)細胞凋亡研究中認為Caspase-3與JNK的激活有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)活化的Caspase-3在銅誘導24 h開始升高，48 h達到最高點，遲于磷酸化的JNK，因此可以推測Caspase-3位于JNK的下游。Troy等〔30〕研究中也發(fā)現(xiàn)JNK是Caspase-2，-3活化的上游信號蛋白。Carbom等〔31〕在沙土鼠持續(xù)缺血模型中檢測了JNK信號通路在海馬CAl區(qū)神經(jīng)元凋亡中的作用，研究表明腦缺血后海馬CA1區(qū)Caspase-3與p-c-jun表達呈正相關(guān)，并得出推論，局灶性腦缺血后各種刺激因素導致p-c-jun過度激活，再通過一系列的凋亡蛋白激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終以Caspase-3為凋亡的最終執(zhí)行者，引起細胞凋亡。同時大量研究認為激活的JNK可以聚集到線粒體外膜上，催化Bcl-2家族抗凋亡蛋白磷酸化而失去活性，從而促進細胞凋亡，最終導致線粒體損傷，活化 caspase-3，啟動依賴 caspase通路的凋亡程序〔32〕。Moosavi等〔33〕卻發(fā)現(xiàn) Caspase 可激活 MAPKs通路中上游蛋白激酶，這些活化的蛋白激酶可以誘導JNK和/或p38磷酸化，表達P53和Fas配體等轉(zhuǎn)錄蛋白，誘導細胞凋亡。Sun等〔34〕認為JNK-MAPK活化后可上調(diào)TNF-α的合成，從而啟動依賴Caspase的受體凋亡途徑 而TNF-α反過來又促進JNKMAPK的進一步活化，從而形成一個惡性循環(huán)使其效應(yīng)進一步放大。所以Caspase與JNK在腦缺血再灌注后細胞凋亡是相互關(guān)聯(lián)，關(guān)于其具體機制還不太清楚，所以JNK與Caspase的相互調(diào)控關(guān)系還有待進一步明確。

4 結(jié)語

腦缺血再灌注可誘導細胞凋亡，如何阻止這種遲發(fā)性神經(jīng)元死亡挽救缺血半暗帶成為目前治療的主要方向〔35〕腦缺血再灌注后細胞凋亡機制是一個復(fù)雜的多因素過程，對細胞凋亡機制的探討及減少凋亡的發(fā)生有重要的現(xiàn)實意義。目前，盡管對JNK信號通路和Caspase在腦缺血再灌注后細胞凋亡中作用的研究取得了一些進展，但要完全揭示其作用機制，還需深入研究。深入研究JNK信號轉(zhuǎn)導通路與Caspase在細胞凋亡中的關(guān)系，有助于進一步闡明細胞凋亡的機制，并可能提供腦血管疾病預(yù)防和治療的新思路。

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