抗菌肽酵母表達系統(tǒng)的研究進展

東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 李 靜 馮興軍＊ 宋雪瑩

抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導產(chǎn)生的一類具有生物學活性的小分子多肽，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分（Brogden和 Kim，2005），廣泛分布于細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物以及人類體內(nèi)（Robert，2001）?？咕木哂锌咕?、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用（Jin 等，2006；Li等，2005）。 和抗生素相比，抗菌肽具有分子質(zhì)量小、水溶性好、耐熱性強、無免疫原性、抗菌譜廣、無耐藥性和作用機制獨特等特點，因此被認為是能夠成為替代抗生素的首選藥物。近幾年來，有關抗菌肽及其應用逐漸成為藥理學、免疫學、分子生物學等領域研究的熱點，抗菌肽在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及食品工業(yè)等領域都具有廣泛的應用前景。但其來源和制備是限制抗菌肽應用的主要瓶頸。目前通過基因工程方法制備抗菌肽為其提供了手段，酵母表達系統(tǒng)在表達抗菌肽方面具有多方面優(yōu)勢，本文綜述了酵母表達系統(tǒng)重組表達抗菌肽的最新研究進展。

1 抗菌肽概述

依據(jù)其來源，可將抗菌肽分為微生物抗菌肽、植物抗菌肽和動物抗菌肽。根據(jù)氨基酸形成和結(jié)構(gòu)特征，可將抗菌肽分為4類：天蠶素類、防御素、蛙皮素、蜂毒素（Brahmacharym等，2004）。對于抗菌肽的作用機理，不同學者有不同的看法，目前研究的最為清楚的是膜滲透機理，認為大多數(shù)抗菌肽的作用機理是抗菌肽利用自身結(jié)構(gòu)特點，在細菌細胞膜上形成電勢依賴性通道，改變細胞膜的通透性，造成細胞內(nèi)容物外泄而死亡。具體過程是抗菌肽分子通過其兩親性α-螺旋上的正電荷與細菌細胞質(zhì)膜磷脂分子上的負電荷之間的靜電吸引而結(jié)合在質(zhì)膜上，緊接著抗菌肽分子中的疏水端插入到質(zhì)膜中，之后α-螺旋也插入到質(zhì)膜中，這樣就打亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序，使細菌失去了膜勢，不能保持正常的滲透壓而死亡（Lehrer等，1989）。

2 畢赤酵母表達系統(tǒng)表達抗菌肽的優(yōu)勢

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種甲基營養(yǎng)型酵母，在缺乏抑制性碳源（如葡萄糖、甘油）時，能利用甲醇作為唯一碳源。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)經(jīng)長期發(fā)展，已基本成為可以生產(chǎn)多種融合蛋白的高效表達系統(tǒng)。它不僅可以克服大腸桿菌表達系統(tǒng)缺乏轉(zhuǎn)錄后加工修飾的缺陷，生產(chǎn)可溶的、具有正確折疊的重組蛋白，而且可以對蛋白進行轉(zhuǎn)錄后加工（Daly 和 Hearn，2005）。

由于從天然資源中提取抗菌肽成本高、得率低、工序繁瑣，化學合成則價格相當昂貴，難以應用生產(chǎn)，因此，利用基因工程技術生產(chǎn)抗菌肽具有重要意義?？咕谋旧韺υ怂拗骶臍饔?，不適合在原核系統(tǒng)中直接表達，一般選用真核表達。由于畢赤酵母表達系統(tǒng)不僅具有原核表達系統(tǒng)繁殖迅速、費用低廉及操作方便的特點，還具有真核表達系統(tǒng)能對表達的蛋白進行正確加工、折疊及適度糖基化的優(yōu)點，因此已越來越廣泛地用于蛋白質(zhì)的表達，目前為止已有許多蛋白質(zhì)都利用巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)進行了成功重組表達（Macauley-Patrick等，2005）。利用酵母表達系統(tǒng)表達抗菌肽，具有以下優(yōu)點：（1）酵母自身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)較少，簡化了后期蛋白質(zhì)的分離與純化，且高分泌的外源蛋白可從無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中分離出來。（2）酵母中存在酵母醇氧化酶AOX1，特別適用于外源蛋白質(zhì)的調(diào)控表達。（3）和大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達產(chǎn)物的累積不會對自身產(chǎn)生毒害作用，由于畢赤酵母存在過氧化物酶體，表達的蛋白質(zhì)貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細胞的毒害作用。HD5α（人源α防御素5）對原核表達宿主有毒害作用，而選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)，使HD5α獲得成功表達（Wang等，2009）。 （4）畢赤酵母表達菌株很容易從搖瓶培養(yǎng)擴大到大批量高密度發(fā)酵，且不影響外源基因的表達水平，為抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎。申艷敏等（2008）選擇畢赤酵母偏好密碼子，高效表達人源抗菌肽LL-37基因。Kim等（2009）將人源抗菌肽 pPICZaA：：hCAP18/LL37 質(zhì)粒整合到畢赤酵母（X33）的5’-AOX1部位，成功表達了LL37。

3 畢赤酵母表達抗菌肽的策略

為了提高抗菌肽的表達量，消除溶血性，增強抗菌活性，采用了各種不同的表達策略利用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行表達，包括直接表達、融合表達、改造后表達、串聯(lián)表達等，均得到較為理想的結(jié)果。

3.1 抗菌肽的改造后表達 有些抗菌肽有溶血作用，且抗菌活性相對較弱，但經(jīng)人為改造后會明顯增強其抗菌活性，溶血毒性降低或消失。Cao等（2010）根據(jù)天蠶素和蜂毒素的氨基酸序列重新設計改造后獲得兩種新型抗菌肽CA （1-7）-M （4-11） （CAM） 和 CB（1-7）-M（4-11） （CBM），并分別在畢赤酵母中成功表達和純化后，經(jīng)活性測定后發(fā)現(xiàn)兩種抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、芽孢桿菌、蘇蕓金桿菌和沙門氏菌均有較強的抗菌活性。CAM和CBM的MIC 值分別為 100 μg/mL 和 125 μg/mL， 其相對效價分別為0.862和0.849。經(jīng)溶血活性測定，顯示CAM和CBM在體內(nèi)和體外均沒有溶血性，具有良好的應用前景。姜新等（2007）參照畢赤巴斯德酵母的偏好密碼子，改造克隆雜合抗菌肽CAM和CBM基因，將改造后的基因克隆到pPICZα-A載體中，構(gòu)建分泌型表達載體pPICZα-A-CAM和pPICZα-A-CBM，在甲醇的誘導下進行表達，結(jié)果表明，雜合抗菌肽獲得表達，兩種表達產(chǎn)物具有明顯的抗菌活性。張建峰等（2008）參照Tossietal的分析方法，在天然哺乳動物cathelictidin家族抗菌肽序列比較和兩親性分析的基礎上，提取出兩親α-螺旋抗菌肽模式肽PGYa，然后根據(jù)其氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，設計合成了新型抗菌肽模式肽PGYa基因，利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功分泌表達了這種分子質(zhì)量約為2.8 kDa的PGYa。經(jīng)測定，PGYa對革蘭氏陰性的 Escherichia coli DH5α有一定的抑殺作用。Jin等（2006）等首次在酵母表達系統(tǒng)中表達分子質(zhì)量小于3.0 kDa的外源雜合抗菌肽CA-MA（天蠶素A（1–8）–馬蓋寧 2（1–12）），并獲得較強抗菌活性。

3.2 抗菌肽的串聯(lián)表達 Niu等（2008）為了獲得高活性的抗菌肽，將4種抗菌肽的基因序列串聯(lián)起來，在每種抗菌肽N基端加上生產(chǎn)Kex2酶切位點，然后將編碼4種抗菌肽的基因連接與pPICZαA的α-分泌信號肽后端，構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，經(jīng)甲醇誘導表達后，串聯(lián)的4種抗菌肽成功獲得表達，且大部分以單體存在，經(jīng)測定重組表達的抗菌肽具有熱和酸穩(wěn)定性，且對多種革蘭氏陰性和陽性菌有較高的抗菌活性。王秀青等（2007）通過重疊區(qū)擴增基因拼接法（SOE）合成抗菌肽天蠶素B基因，并在其N端引入Kex2酶切位點。亞克隆天蠶素B并將3個亞克隆串聯(lián)在一起，每個單體前都加上Kex2酶切位點，將天蠶素B以及串聯(lián)體連接與表達載體pPICZαA，用SacⅠ酶切使之線性化，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168，成功獲得表達，經(jīng)檢測，表達產(chǎn)物具有明顯抑菌活性。

3.3 抗菌肽的融合表達 喬紅偉等（2008）將中國林蛙皮膚抗菌肽基因（RC）克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9K上，使之準確融合于α-分泌信號肽后端，構(gòu)建pPIC9K/RC，然后通過電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115/His-。將篩選出的高效表達的重組轉(zhuǎn)化子用甲醇作誘導劑進行小瓶發(fā)酵，28～30℃誘導后，表達產(chǎn)物在α信號因子引導下分泌到培養(yǎng)基中，分泌到培養(yǎng)基中的表達產(chǎn)物能夠抑殺細菌和抑制腫瘤細胞生長。

3.4 抗菌肽的直接表達 很多抗菌肽由于其自身的結(jié)構(gòu)特點無需改造加工，可直接在酵母中進行表達，且能獲得高效表達。蔡晶等（2009）將黑鯛抗菌肽hepcidin前體肽和成熟肽Pro-AS-hepc2基因與酵母表達載體連接，構(gòu)建的表達載體，利用α-分泌信號肽進行分泌表達，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，在甲醇誘導下成功表達了黑鯛Pro-AS-hepc2，至120 h表達量最高，表達產(chǎn)物有顯著的抑菌活性，對革蘭氏陽性細菌、陰性細菌都有作用，證明獲得了有抗菌活性的重組Pro-AS-hepc2表達產(chǎn)物。

4 展望

由于抗菌肽無殘留、無毒害且具有良好的廣譜抗菌性能，正受到越來越多的關注。隨著對抗菌肽的性質(zhì)和特征進一步研究，發(fā)現(xiàn)用不同表達體系表達效果不同。近年來利用畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)成功表達了多種抗菌肽，但仍需探索提高抗菌肽表達量、增強抗菌活性的方法。

[1]蔡晶，楊明，蔡靈，等.黑鯛抗菌肽hepcidin在畢赤酵母中的表達及其抗菌活性[J].廈門大學學報，2009，48（5）：738 ～ 743.

[2]姜新，馬根，許正超，等.兩種雜合抗菌肽在畢赤酵母中的表達及活性測定[J].四川大學學報，2007，44（3）：673 ～ 678.

[3]喬紅偉，韓俊友，趙瑞利，等.中國林蛙抗菌肽基因在畢赤酵母中的表達及其活性檢測[J].中國獸醫(yī)學報，2008，28（6）：663 ～ 671.

[4]申艷敏，魏建超，尚書文，等.人源抗菌肽LL-37在畢赤酵母中的高效表達及其活性檢測[J].微生物學通報，2008，35（4）：539 ～ 544.

[5]王秀青，張素芳，曹瑞兵，等.抗菌肽天蠶素B基因及其串聯(lián)體在畢赤酵母中的表達[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2007，30（3）：120 ～ 123.

[6]張建峰，蔣宗勇，唐兆新，等.抗菌肽模式肽PGYa的分子設計、克隆及在畢赤酵母中的分泌表達[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報，2008，16（1）：154 ～ 157.

[7]Brahmacharym，Krishan S P，Koh J L，et al.A database of antimicrobial sequences[J].Nucleic Acids Res，2004，32（1）：586 ～ 589.

[8]Brogden，Kim A.Antimicrobialpeptides：pore formersormetabolic inhibitors in bacteria[J].Nature Reviews Microbiology，2005，3：238 ～ 250.

[9]Cao Yu，Yu Rong-qing，Liu Yi，et al.Design，recombinant expression，and antibacterial activity of the Cecropins-Melittin hybrid antimicrobial peptides[J].Current Microbiology，2010，61（3）：169 ～ 175.

[10]Daly Rachel，Hearn M T W.Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris：a useful experimental tool in protein engineering and production[J].Journal of Molecular Recognition，2005，18：119 ～ 138.

[11]Jin F l，Xu X X，Wang L X，et al.Expression of recombinant hybrid peptide cecropinA （1 ～ 8）-magainin2 （1 ～ 12）in Pichia pastoris：Purification and characterizaion[J].Protin Expression and Purification，2006，50：147 ～ 156.

[12]Jin F L，Xu X X，Zhang W Q，et al.Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast，Pichia pastoris[J].Protein Expression and Purification，2006，49：39 ～ 46.

[13]Lehrer R J，Barton A，Daher K A，et al.Interaction of human defensins with Escherichia coli：mechanism of bactericidal activity[J].Journal of Clinical Investigation，1989，84：553.

[14]Li L，Wang J X，Zhao X F，et al.High level expression，purification，and characterization of the shrimp antimicrobial peptide，Ch-penaeidin，in Pichia pastoris[J].Protein Expression and Purification，2005，39：144 ～ 151.

[15]Macauley-Patrick S，F(xiàn)azenda M L，McNeil B，et al.Heterologous protein production using thePichia pastorisexpression system[J].Yeast，2005，22：249 ～270.

[16]Niu M F，Li X，Wei J C，et al.The molecular design of a recombinant antimicrobial peptide CP and its in vitro activity[J].Protein Expression and Purification 2008，57：95 ～ 100.

[17]Robert E W H.Cationic peptides：effectors in innate immunity and novel antimicrobials[J].The lancet Infectious Diseases，2001，1：156 ～ 164.

[18]Wang A P，Wang S，Shen M Q，et al.High level expression and purification of bioactive human α-defensin 5 mature peptide in Pichia pastoris[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84：877 ～ 884.