高原藏系綿羊EPAS1基因的克隆以及組織表達(dá)研究

烏仁塔娜 劉 芳 白振中 嘎 琴 格日力

（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001）

EPAS1是哺乳動(dòng)物機(jī)體功能在缺氧條件下的重要氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子。其蛋白屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員，由氧敏感的α亞基和核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的β亞基以異源二聚體形式存在。近來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，EPAS1參與諸多低氧有關(guān)的下游基因的表達(dá)調(diào)控，從而在低氧調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1,2]。因此結(jié)合我們正在開展的有關(guān)低氧獲得性習(xí)服相關(guān)的研究，對(duì)青藏高原獲得性習(xí)服物種藏系綿羊EPAS1的基因進(jìn)行了克隆及序列分析，以便為進(jìn)一步研究高原獲得性習(xí)服以及急慢性高原病的發(fā)病機(jī)制的研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

2009年4月在青海省可可西里國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（海拔4300m）捕獲雄性藏系綿羊10只，捕捉后立即運(yùn)至格爾木市（海拔2800m）解剖取藏系綿羊各組織，迅速投入液氮容器中，低溫保存并運(yùn)回西寧。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及鑒定

按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取藏系綿羊肺組織總RNA，溶于20μL DEPC水中，并用DU800核酸蛋白含量檢測(cè)儀測(cè)定A260/A280值及濃度，并進(jìn)行1%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因擴(kuò)增及序列測(cè)定

引物設(shè)計(jì)：利用GenBank中人、小鼠、大鼠、牛和牦牛的EPAS1 cDNA序列用ClustalW進(jìn)行同源性對(duì)比。

目的基因的擴(kuò)增：取總RNA 2.0μg，按照AMV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 1μL，PCR Master Mix 15μL，EPAS1上下游引物各1μL，加水補(bǔ)足至25μL；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每循環(huán)95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物10μL 進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，采用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的回收、純化及序列測(cè)定：用 QIAquick Gel 回收試劑盒回收純化456bp PCR擴(kuò)增片段并連接到 pGEM-T Easy載體上。通過(guò)藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)挑取白斑單克隆，接種后37℃搖床過(guò)夜，然后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ酶切電泳，選出含有目的片段的陽(yáng)性克隆送上海英俊生物生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將獲得的基因序列在GenBank上進(jìn)行Blast初步比較分析和在ClustalX上進(jìn)行物種同源性比較。

1.2.3 熒光定量PCR

采用CluxtalW軟件對(duì)人、大鼠、小鼠、牛的Beta- actin，EPAS1，EPO的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。定量PCR由iCycler 定時(shí)定量PCR儀來(lái)完成。結(jié)果顯示溶解曲線只出現(xiàn)一個(gè)主波峰，說(shuō)明PCR擴(kuò)增的特異性較高，符合實(shí)時(shí)熒光定量的技術(shù)要求。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果分析

用DNAMAN軟件，將藏系綿羊EPAS1基因測(cè)序序列與其他物種進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果顯示與人、大鼠、小鼠、牛的EPAS1基因的同源性分別達(dá)到了94%、91%、92%、98%的同源性。

2.2 熒光定量PCR（ΔΔCt方法）檢測(cè)結(jié)果

以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算藏系綿羊各個(gè)組織的EPAS1的ΔCt?？梢钥闯鯡PAS1基因mRNA的表達(dá)量在心臟中最高，約是肺臟的1.8倍，在肝臟中表達(dá)量的2.5倍，約是在腎中表達(dá)量的7.57倍。

3 討 論

本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)首次從草地藏系綿羊肝臟中獲得了EPAS1基因的部分編碼區(qū)序列，為進(jìn)一步研究藏系綿羊EPAS1的表達(dá)及其與高原地區(qū)獲得性習(xí)服機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。我們進(jìn)行了EPAS1 mRNA在藏系綿羊的心、腎、肝、肺組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EPAS1基因mRNA在藏系綿羊心臟組織中表達(dá)量最高。故可認(rèn)為在藏系綿羊中EPAS1基因的在心臟中的高表達(dá)可能與其在低氧環(huán)境下藏系綿羊的心臟保護(hù)性改變有著重要的關(guān)系。

綜上所述長(zhǎng)期適應(yīng)高海拔低氧的獲得性習(xí)服物種藏系綿羊，對(duì)低氧已經(jīng)形成了部分適應(yīng)性改變，且在分子水平，生理水平，形態(tài)水平已經(jīng)有了一定的改變，這對(duì)青藏高原移居物種在低氧習(xí)服機(jī)制的研究有著重要的價(jià)值。通過(guò)對(duì)藏系綿羊EPAS基因的研究，可以有助于對(duì)慢性高原病的發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

[1]管峰,石國(guó)慶,劉守仁,等.角蛋白家族及其對(duì)羊毛生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控[J].生命的化學(xué),2007,27(1)：92-94.

[2]謝馥交,盧向陽(yáng).克隆全長(zhǎng)cDNA的方法及其在獸藥研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)獸藥雜志,2006,40(5)：43-47.