神經(jīng)干細(xì)胞概述及治療視神經(jīng)損傷的應(yīng)用進(jìn)展

張曉鵬 程 輝

（山東萬杰醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，山東 淄博 255213）

1 NSCs概述

1.1 NSCs的定義

Reynolds[1]等于1992年從小鼠紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖并具有多種分化潛能的細(xì)胞群，第一次提出了神經(jīng)干細(xì)胞的概念。1997年McKay[2]正式將神經(jīng)干細(xì)胞的概念總結(jié)為：一類具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。

1.2 NSCs的來源

1.2.1 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞是指當(dāng)受精卵分離發(fā)育成囊胚時內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。1981年，Evans和Kaufman[3]首次成功分離小鼠胚胎干細(xì)胞，而后國內(nèi)外研究人員進(jìn)行了大量的研究，而且證明在體外，胚胎干細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型，為胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化打下了基礎(chǔ)。目前，胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的方法主要有以下幾種：①Bain[4]等在維甲酸或生長因子處理下，懸浮培養(yǎng)形成胚狀體，由此得到神經(jīng)前體細(xì)胞或者神經(jīng)細(xì)胞。然后用免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實其是神經(jīng)細(xì)胞，并且在基因轉(zhuǎn)錄水平也同樣檢測證實。另外，有研究表明將胚胎干細(xì)胞通過該方法誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下腔后，神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)一步分化為神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[5]。該方法的缺點(diǎn)是神經(jīng)干細(xì)胞的產(chǎn)物中可能并存其他細(xì)胞譜系。②胚胎干細(xì)胞與中胚層來源的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。Nakayama[6]等將鼠胚胎干細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，得到大量的神經(jīng)干細(xì)胞。③利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子選擇性擴(kuò)增神經(jīng)前體細(xì)胞的培養(yǎng)體系。堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)早期神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，Okabe[7]等根據(jù)這一特性建立利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子選擇性擴(kuò)增神經(jīng)前體細(xì)胞的培養(yǎng)體系。該方法解決了Bain方法的缺點(diǎn)，是目前胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞公認(rèn)的方法。胚胎干細(xì)胞因受倫理道德、法律、潛在致瘤性和組織相容性等問題困擾，限制了胚胎干細(xì)胞的來源和應(yīng)用。

1.2.2 成體神經(jīng)組織來源的神經(jīng)干細(xì)胞

成體神經(jīng)干細(xì)胞存在于成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，如海馬齒狀回的顆粒下層、側(cè)腦室的室管膜下區(qū)、紋狀體等部位。來自側(cè)腦室室管膜下區(qū)的新生神經(jīng)元可以遠(yuǎn)距離遷徙到達(dá)嗅球形成嘴側(cè)遷移流[8,9]。成體神經(jīng)干細(xì)胞在不同因素的刺激下，可分化為不同類型的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。不同部位來源的細(xì)胞進(jìn)行增殖和分化需要的條件也不相同。如來自腦皮質(zhì)的神經(jīng)干/祖細(xì)胞在體外增殖、分化為神經(jīng)元需要堿性成纖維細(xì)胞生長因子；而來自視網(wǎng)膜的神經(jīng)干/祖細(xì)胞則不需要任何絲裂原。

1.2.3 成體非神經(jīng)組織來源的神經(jīng)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化成間質(zhì)起源的任意組織的潛能，包括向神經(jīng)元樣細(xì)胞、軟骨、造血基質(zhì)及骨等分化成熟的特征[10,11]。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅存在于骨髓中，也可以從臍血、外周血中分離[12]，有研究者從臍帶靜脈內(nèi)皮下層也分離出間充質(zhì)干細(xì)胞[13]。Miller[14]等應(yīng)用表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子2培養(yǎng)基，從新生鼠和成年鼠的真皮細(xì)胞層內(nèi)成功培養(yǎng)出NSCs。但是間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞缺點(diǎn)是：需要較高的條件，往往分化為神經(jīng)干細(xì)胞的比例很低，腦內(nèi)表達(dá)為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量較少，致使間充質(zhì)干細(xì)胞的研究仍只限于動物實驗。優(yōu)點(diǎn)是：其來源廣泛，不受倫理等問題的束縛，所以仍是目前研究的熱點(diǎn)。

1.3 NSCs的生物特性

NSCs的主要生物特性包括：①多向分化潛能：神經(jīng)干細(xì)胞可以向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。②自我更新：神經(jīng)干細(xì)胞具有對稱分裂及不對稱分裂兩種分裂方式。通過對稱分裂產(chǎn)生兩個干細(xì)胞或者2個祖細(xì)胞，通過不對稱分裂產(chǎn)生一個新的干細(xì)胞和一個祖細(xì)胞。③低免疫源性：神經(jīng)干細(xì)胞是未分化的原始細(xì)胞，不表達(dá)成熟的細(xì)胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識別。④組織融合性好：可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長期存活。

1.3 神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)分化調(diào)控機(jī)制

目前絕大多數(shù)研究者認(rèn)為NSCs的分化調(diào)控機(jī)制主要有兩種：自身基因調(diào)控和外源性信號調(diào)控?；蛘{(diào)控是指NSCs自身的轉(zhuǎn)錄因子及其他功能蛋白對其發(fā)育的調(diào)控。許多轉(zhuǎn)錄因子參與了NSCs的增殖、分化過程。如bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族[15]，其中家族中的MASH-1（mammalian aehaete-scute homolog-1）基因的表達(dá)使干細(xì)胞向神經(jīng)元前體細(xì)胞分化；Ngn1和Ngn2基因促使干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化；Olig基因決定少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化；該家族還包括Mash1、NeuroD等因子。除此以外，轉(zhuǎn)錄抑制因子N-coR（the nuclear receptor Co-repressor）能抑制神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化[16]；Notch基因抑制干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化；Wnt[17]基因在NSCs增殖分化中也起重要調(diào)節(jié)作用。

外源性信號調(diào)控指微環(huán)境對NSCs發(fā)育的調(diào)控，包括細(xì)胞因子、骨形態(tài)形成蛋白（BMPs）、微環(huán)境等多個方面。大量實驗表明，細(xì)胞因子如表皮生長因子（EGF）和成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）都能維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力。其他神經(jīng)因子如血小板生長因子（PDGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、白細(xì)胞介素（IL-1）、淋巴細(xì)胞抑制因子（LIF）均起協(xié)同調(diào)節(jié)作用。另一種就是骨形態(tài)形成蛋白（BMPs），BMPs在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮多種作用，并對神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用產(chǎn)生影響。在胚胎早期，可抑制細(xì)胞增生；在后期，低濃度的BMPs促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，但在發(fā)育的所有時期，BMPs抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生[18]。微環(huán)境指能對NSCs分化產(chǎn)生影響的周圍結(jié)構(gòu)成分。人們發(fā)現(xiàn)：促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的因素可以促進(jìn)神經(jīng)元的增殖，提示NSCs的發(fā)生與內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)生也有一定關(guān)系；同時神經(jīng)元的發(fā)生亦受到其他神經(jīng)細(xì)胞的影響，如來源于成人海馬區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)NSCs的增殖和分化[19]；而來源于脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞并不能促進(jìn)神經(jīng)的發(fā)生，進(jìn)一步證明局部的微環(huán)境對NSCs的影響。自身基因調(diào)控和外源性信號調(diào)控相互作用，共同調(diào)節(jié)控制干細(xì)胞的增殖和分化。

2 神經(jīng)干細(xì)胞移植

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞移植的可行性

神經(jīng)干細(xì)胞能夠應(yīng)用于研究視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷，主要與眼球的局部特點(diǎn)密不可分。①眼球的解剖結(jié)構(gòu)清晰，屈光物質(zhì)透明，眼球體積小、組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)密、與體循環(huán)相對分離等特點(diǎn)，有利于操作、定位和觀察。②眼球具有免疫赦免機(jī)制，能誘導(dǎo)免疫偏離，產(chǎn)生免疫耐受。眼球的免疫赦免使得視網(wǎng)膜下腔和玻璃體腔對外來基質(zhì)的相對無反應(yīng)狀態(tài)都為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷提供了免疫學(xué)基礎(chǔ)。但是，眼球的免疫赦免是相對的，在移植過程中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞等相關(guān)APC均參與了免疫排斥反應(yīng)。使用免疫抑制劑和免疫耐受狀態(tài)的產(chǎn)生可以有效地降低細(xì)胞移植后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[20]。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞移植方式

目前，神經(jīng)干細(xì)胞移植視網(wǎng)膜主要通過兩條途徑實現(xiàn)：一是玻璃體腔移植，一般將帶有玻璃微型針頭的微量注射器在角膜鞏膜緣扁平部插入玻璃體腔，抽出1.5μL左右的玻璃體，再注入等體積的神經(jīng)干細(xì)胞懸液。另一種方法是視網(wǎng)膜下腔移植，通常是在光學(xué)顯微鏡下，使用微型刀片在視網(wǎng)膜赤道部做一個小切口，然后用帶30號針頭的微量注射器穿鞏膜、脈絡(luò)膜進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔，注入3～4μL細(xì)胞懸液。由于移植的干細(xì)胞具有遷移整合能力，通過上述兩種方法，細(xì)胞均可整合入視網(wǎng)膜，但實驗觀察到視網(wǎng)膜下腔注射損傷較大，且容易造成視網(wǎng)膜脫離。

2.3 神經(jīng)干細(xì)胞移植后的作用

Nishida[21]等將大鼠海馬來源的神經(jīng)干細(xì)胞移植入機(jī)械性損傷的大鼠玻璃體腔內(nèi)，分別于1、2、4周做組織化學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞已長入宿主視網(wǎng)膜，并表達(dá)Map2ab、Map5、GFAP，結(jié)果表明神經(jīng)干細(xì)胞移植有助于修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜。Suzuki[22]等將海馬來源的神經(jīng)干細(xì)胞移植入新生小鼠眼內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞整合到宿主的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層。免疫組化顯示多數(shù)細(xì)胞能表達(dá)巢蛋白，并表現(xiàn)出微管相關(guān)蛋白的免疫活性。證明神經(jīng)干細(xì)胞能向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，同時也發(fā)現(xiàn)腦衍生神經(jīng)生長因子（BDNF）能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和提高其成活率。Wang等[23]將NGF基因修飾的神經(jīng)前體細(xì)胞移植到玻璃體腔和視網(wǎng)膜下腔，觀察其對視神經(jīng)軸漿流中斷視神經(jīng)病變的治療作用，發(fā)現(xiàn)：NGF基因修飾的神經(jīng)前體細(xì)胞注入玻璃體腔和視網(wǎng)膜下腔，均能夠表達(dá)NGF，最長時間達(dá)1個月之久。在7d和15d分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子對損傷下的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞起到明顯的保護(hù)作用。Dong等[24]用轉(zhuǎn)化生長因子β3誘導(dǎo)海馬來源的NSCs后移植入視網(wǎng)膜后發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞可表達(dá)成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)志。最近有學(xué)者將加強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)的海馬祖細(xì)胞（AHPCs）通過玻璃體腔內(nèi)注射移植到高壓損傷眼，免疫組織化學(xué)分析AHPCs在損傷的視網(wǎng)膜環(huán)境中存活并分化，表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)志。但是瞳孔對光反射和視網(wǎng)膜電流圖分析在受體眼中未見分化出功能性產(chǎn)物。Tropepe等發(fā)現(xiàn)成年小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存在NSCs，打破了認(rèn)為哺乳動物視網(wǎng)膜內(nèi)不存在NSCs的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。Chacko等[25]向出生2周大鼠視網(wǎng)膜下腔移植培養(yǎng)的來源于視網(wǎng)膜的NPC，發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞能與視網(wǎng)膜整合并表達(dá)感光細(xì)胞的標(biāo)志物Opsin和Arrestin。較其他用于視網(wǎng)膜移植的干細(xì)胞而言，來源于視網(wǎng)膜的NSCs一直處于視網(wǎng)膜的生長、發(fā)育環(huán)境中，具有更大的向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的潛能。在國內(nèi)，柳浩然[26]等觀察了神經(jīng)干細(xì)胞移植能促進(jìn)視神經(jīng)損傷大鼠視網(wǎng)膜表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子以及神經(jīng)干細(xì)胞移植入視神經(jīng)損傷大鼠玻璃體腔后可提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率、對受損的節(jié)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。同時研究發(fā)現(xiàn)NSCs移植入視神經(jīng)損傷大鼠視網(wǎng)膜后作閃光視覺誘發(fā)電位顯示，P1波幅顯著下降，1周內(nèi)下降速度較快，2周至4周下降幅度漸趨于平緩；P1波峰潛時逐步上升，到4周時顯示回落趨勢，說明髓鞘功能有開始恢復(fù)的跡象。閃光視覺誘發(fā)電位反映里視神經(jīng)損傷及NSCs移植后的視神經(jīng)傳導(dǎo)功能的變化，發(fā)現(xiàn)NSCs早期移植可減緩視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡，有效促進(jìn)損傷視神經(jīng)傳導(dǎo)功能的修復(fù)。最近Wang[27]等從人胚胎大腦皮層分離獲得神經(jīng)干細(xì)胞，然后移植入出生后21d大鼠的玻璃體腔內(nèi)，并在出生后不同時間點(diǎn)檢測大鼠的空間頻率敏感度和亮度閾值?？臻g頻率敏感度顯示在出生后90d為（0.54±0.04）周期/度，這個數(shù)字可以達(dá)到正常值的90%（0.6周期/度），亮度閾值為3.0對數(shù)單位；而未植入神經(jīng)干細(xì)胞的大鼠在出生后90d僅為（0.16±0.05）周期/度，亮度閾值僅0.6對數(shù)單位。在出生后150d和270d也空間頻率敏感度可以達(dá)到（0.49±0.05）和（0.22±0.02）周期/度，分別是正常值的82%和37%。實驗證實人胚胎大腦皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞能夠有效地延緩大鼠視力的進(jìn)一步惡化，并且這種持續(xù)治療作用可以達(dá)6個月。

3 問題及展望

神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新、多向分化潛能，使其非常適合進(jìn)行細(xì)胞移植，而機(jī)體內(nèi)廣泛存在的神經(jīng)干細(xì)胞加上體外培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)為移植提供了充足的細(xì)胞源。大量的動物實驗證實了神經(jīng)干細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下腔或者玻璃體腔后能夠在宿主視網(wǎng)膜內(nèi)遷移、分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并能夠整合到視網(wǎng)膜內(nèi)，建立廣泛的細(xì)胞連接。然而，目前所進(jìn)行的研究主要是動物實驗，缺乏臨床實驗數(shù)據(jù)；而且神經(jīng)干細(xì)胞在移植到體內(nèi)后如何分化為目的細(xì)胞，分化調(diào)控機(jī)制還不是很明確，在防止可能出現(xiàn)的腫瘤性分化等方面仍然需要進(jìn)一步的研究。隨著神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)理論的研究深入，神經(jīng)干細(xì)胞移植必將能為視神經(jīng)損傷的治療做出突出的貢獻(xiàn)。

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