旋毛蟲屬分類及其分類方法的研究進展＊

王麗娜，田建麗，陳曉寧，路國兵，高 云

旋毛蟲病（Trichinellosis）是由旋毛蟲引起的一種嚴(yán)重的人獸共患病。旋毛蟲宿主范圍廣泛，可感染人及150多種哺乳動物，呈全球性分布［1］。據(jù)估計，目前全世界旋毛蟲病感染者大約有1 100萬［2］。近幾十年以來，人們一直努力將其控制或消滅，但目前在很多國家仍常有該病的暴發(fā)，現(xiàn)已被列入再度肆虐的疾?。?］。

旋毛蟲被定名起，到目前一直被認(rèn)為該屬存在種群復(fù)合體，研究發(fā)現(xiàn)［4－5］：不同地區(qū)的旋毛蟲分離株對外界環(huán)境的適應(yīng)能力、繁殖力、對宿主的感染性及致病性等方面存在有明顯的差異。近年來很多學(xué)者在旋毛蟲的分類問題上做了大量的研究工作。隨著許多新的旋毛蟲隔離種的發(fā)現(xiàn)，以及分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，在旋毛蟲新隔離種的鑒定和分類上出現(xiàn)了一個嶄新的局面，許多新的旋毛蟲隔離種逐漸被發(fā)現(xiàn)，同時也為傳統(tǒng)的分類學(xué)方法提供可靠的客觀依據(jù)。旋毛蟲屬種分類的研究對旋毛蟲病的病原學(xué)、免疫學(xué)、流行病學(xué)、臨床學(xué)、預(yù)防學(xué)以至最終控制和消滅旋毛蟲病均具有重要的意義。

1 旋毛蟲屬的分類現(xiàn)狀

1.1 國外研究 旋毛蟲系Peacock于1828年在倫敦進行常規(guī)尸檢時首次在人體肌肉內(nèi)發(fā)現(xiàn)。自1835年Owen定名以來，人們認(rèn)為毛形屬只有一個種，即旋毛蟲（Trichinellaspiralis，T1）。Garkavi于1972年報道，在一種寄生于鳥類肌肉中發(fā)現(xiàn)一種非成囊型旋毛蟲，被命名為偽旋毛形線蟲（T.pseudospiralis，T4）。同年Britov和boev根據(jù)旋毛蟲雜交試驗報道了2個新的種類，即本地毛形線蟲（T.nativa，T2）和尼氏毛形線蟲（T.nelsoni，T7），把原有的旋毛蟲（T.spiralis）分為了3個隔離種。至此，130多年來旋毛蟲只有一個種的說法被打破，同時也開辟了旋毛蟲種株研究的先河。

1992 年，La Rosa等［6］和 Pozio等［7］認(rèn) 為 有 8個基因庫，即5個旋毛蟲隔離種：旋毛形線蟲（T.spiralis，T1）、本地毛形線蟲（T.nativa，T2）、偽旋毛形線蟲（T.pseudospiralis，T4）、尼氏毛形線蟲（T.nelsoni，T7）、布氏毛形線蟲（T.britovi，T3）和3個未確定分類地位的基因型（T5、T6、T8）。隨后由于不斷暴發(fā)旋毛蟲病，一些新的旋毛蟲隔離種被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。1999年，Pozio等［8］從巴布亞新幾內(nèi)亞的一頭野豬體內(nèi)分離的一個無包囊的旋毛蟲隔離種并對其進行分析，表明這是一個新種，命名為巴布亞旋毛蟲（T.papuae，T10）。同年，Nagano等［9］對9個旋毛蟲分離株進行限制性片段長度多態(tài)性分析，確定從日本得到的曾被認(rèn)為是布氏旋毛蟲的一個分離株是旋毛蟲屬的一個新的基因型，命名為T9。2000年，Pozio等［10］對已被定名為T5，來自新北區(qū)的32個旋毛蟲隔離種從生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面進行了重新研究，將最早認(rèn)為是旋毛蟲一個基因型的T5命名為米氏旋毛形線蟲（T.murrelli，T5）。2002年，Pozio等［11］在津巴布韋的鱷魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種無包囊的旋毛蟲，命名為津巴布韋旋毛蟲（T.zimbabwensis，T11）。

因此，目前國際上已將毛形屬分為8個種，即T.spiralis（T1）、T.nativa（T2）、T.britovi（T3）、T.pseudospiralis（T4）、T.murrelli（T5）、T.nelsoni（T7）、T.papuae（T10）、T.zimbabwensis（T11），以及3個分類地位尚未確定的基因型，即T6、T8和T9。

1.2 國內(nèi)研究 我國與法國及丹麥同行合作，自1995年起，歷經(jīng)8年的時間，在國內(nèi)首次對我國不同地域及不同動物的21株旋毛蟲分離株進行了全面系統(tǒng)的種類鑒定與流行病學(xué)分析，結(jié)果顯示我國主要存在2個旋毛蟲種，即豬的T.spiralis種及犬的T.nativa種。我國大部分地區(qū)旋毛蟲病主要由T.spiralis引發(fā)，而東北地區(qū)則主要由T.nativa感染犬為主。以上成果為我國旋毛蟲病的進一步研究奠定了良好理論基礎(chǔ)，避免了過去那種實驗結(jié)果無標(biāo)準(zhǔn)性，成果無通用性的局面。目前我國的旋毛蟲分離種已獲國際標(biāo)準(zhǔn)蟲種認(rèn)證和編碼，并已納入國際旋毛蟲蟲種保藏中心（意大利）［12］。1997年，劉明遠(yuǎn)等［13］利用隨意擴增的DNA多態(tài)性技術(shù)對國內(nèi)部分旋毛蟲分離株進行了鑒定與分析，結(jié)果顯示中國的旋毛蟲豬株為T.spiralis，犬株為T.nativa，貓株為T.nelsoni。諸欣平等［14］研究提示黑龍江豬株系T.spiralis，犬株系T.nativa，貓株在分類歸屬上似乎與T.nativa靠近。1998年，劉明遠(yuǎn)等［15］利用生物學(xué)特性測定和隨意擴增的DNA多態(tài)性技術(shù)對貓隔離種進行進一步的鑒定表明，中國的貓分離株為T.nativa。李冬梅等［16］對分離自黑龍江省貓體內(nèi)的旋毛蟲及本地毛形線蟲的18S r RNA基因進行擴增，結(jié)果表明貓旋毛蟲與T.spiralis基因同源性更高。因此，中國旋毛蟲貓株的歸屬問題有待于進一步研究。

2 旋毛蟲屬分類方法的研究進展

旋毛蟲屬分類的研究方法包括形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等。徐克成等［17］收集了中國8個地區(qū)豬犬源旋毛蟲進行了旋毛蟲不同發(fā)育階段（囊包、幼蟲、成蟲）的長度、寬度、囊包形態(tài)學(xué)指數(shù)、幼蟲與成蟲體部指數(shù)的系統(tǒng)測量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)旋毛蟲在不同發(fā)育階段、蟲體本身各階段及各地理株之間雖然有差異，但缺乏一定的規(guī)律性變化，旋毛蟲形態(tài)學(xué)在蟲種分類中缺乏一定的說服力。

2.1 蟲體雜交試驗 生殖隔離是命名蟲種的重要依據(jù)。Pozio等［8，10］發(fā)現(xiàn)旋毛蟲屬米氏旋毛蟲（T5）和巴布亞旋毛蟲（T10）均不與其他種及基因型的旋毛蟲雜交。Britov［18］發(fā)現(xiàn)T1與T7之間存在生殖隔離。但在T1和T3之間可進行單對蟲體雜交，一些雜合體同時攜帶有2種旋毛蟲的基因，提示T1和T3的親緣關(guān)系較近，二者之間存在基因流動［19－20］。許汴利等［21］通過單對蟲體雜交試驗表明河南豬株與黑龍江犬株存在生殖隔離現(xiàn)象，兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，兩者可能分屬不同的蟲種。

2.2 旋毛蟲肌幼蟲對宿主的感染性 不同種乃至不同株的旋毛蟲，其感染性存在差異。繁殖力指數(shù)（RCl）是指宿主感染旋毛蟲后40 d時回收的肌幼蟲數(shù)與感染時接種的肌幼蟲數(shù)的比值。旋毛蟲每個隔離種RCI是相對穩(wěn)定的［22］，因此可用RCI值作為區(qū)分旋毛蟲各隔離種的重要指標(biāo)。T1在小鼠的RCI為94～282，T2的為29～143［23－24］。T1～T5及T7在Wistar大鼠體內(nèi)的RCI分別是185～237、0.02～0.20、0.20～1.00、47.0～62.0、0.70～1.20及0.40～0.80［25］。牛春等［26］比較了旋毛蟲豬株和貓株在小鼠體內(nèi)的RCI，豬株為377.58±294.83，與T1的RCI相符，貓旋毛蟲的RCI為119.06±79.542，與T2的RCI相符。路義鑫等［27］以 T1、T2

分別感染家豬、大鼠和小鼠，T1的RCI值依次為300.55±12.45，32.10±7.77和159.86±7.47；T2的RCI值依次為0.033±0.033，2.66±2.19，58.15±4.69，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。Kapel［28］曾對36頭野豬接種不同種的旋毛蟲（T1、T2、T3、T5、T7）及 T4的3個不同地理株（澳大利亞、美國、前蘇聯(lián)），第5周檢測LPG（每克組織肌幼蟲數(shù)），發(fā)現(xiàn)不同種或同種不同地理株的LPG有明顯差異：T1感染性最強，LPG為296，T3、T7和T4（澳大利亞株）感染性中等，LPG為53～74；其他幾種（株）感染性很弱，LPG在2～16之間。

2.3 同工酶酶譜分析 同工酶系指因遺傳因素引起的初級蛋白結(jié)構(gòu)不同而具有相同催化功能的酶。若同工酶酶譜不同，則標(biāo)志著種株間分子結(jié)構(gòu)的差異。Ayala［29］認(rèn)為只要3個同工酶位點占有不同的等位基因就足以說明基因流發(fā)生了中斷，即有可能分屬于不同的種類。Flockhart［30］最早使用同工酶譜分析技術(shù)從不同旋毛蟲分離株中觀察到不同的同工酶譜。1992年，La Rosa等［6］用27種同工酶分析了來自不同宿主和地區(qū)的152個旋毛蟲株，將其分為明確的8個基因型（T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8）。2001年，La Rosa等［31］用12種同工酶分析了不同地區(qū)無囊包的T4和T10，發(fā)現(xiàn)新北區(qū)和澳大利亞的偽旋毛蟲的同工酶有1種不同，但與巴布亞旋毛蟲有本質(zhì)區(qū)別。張帆等［32］分析比較了中、美豬型旋毛蟲成蟲和幼蟲的2種同工酶的帶譜，結(jié)果表明中、美豬型旋毛蟲成蟲的LDH同工酶無酶帶，而幼蟲則各具1條酶帶，且其遷移率也不同，提示來自不同地域的旋毛蟲在遺傳學(xué)上存在差異。張月清等［33］對中國不同地區(qū)、不同宿主來源的旋毛蟲的6個分離株的8種同工酶進行了研究，結(jié)果顯示長春犬株與其他各株在多數(shù)同工酶酶譜上存在差異，河南2豬株與其它3地豬株旋毛蟲也存在微小差異，而自同一地區(qū)，同一宿主來源，在不同年代的兩株旋毛蟲其同工酶酶譜則完全相同，結(jié)合作者過去的研究成果綜合分析，表明長春犬株與其他各株在同工酶譜、基因組DNA限制性酶譜及可溶性蛋白成份上差異均十分明顯，推測我國旋毛蟲分離株至少可能分為2種不同的生物學(xué)類型。李婷婷等［34］對我國6個豬源旋毛蟲地理株的4種同工酶進行分析，發(fā)現(xiàn)我國6個旋毛蟲地理株的酶譜均與T1相同，表明我國6個旋毛蟲地理株均屬于T1。

2.4 分子生物學(xué) 分子生物學(xué)技術(shù)以其靈敏度高、特異性強等特點為旋毛蟲分類和鑒定帶來了無限生機成為旋毛蟲分類鑒定的有力工具，使得旋毛蟲屬的分類研究進入分子水平，可從基因角度揭示物種進化、分類、親緣關(guān)系及種內(nèi)遺傳變異的本質(zhì)。

2.4.1 限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）RFLP是用特定的限制性內(nèi)切酶對特異的目標(biāo)DNA進行酶切，根據(jù)電泳產(chǎn)生的不同長度的限制性酶切片段來分析目的基因多態(tài)性。RFLP在多種分子生物學(xué)技術(shù)中應(yīng)用相對較早。Kwon等［35］對來自不同國家的T.spiralis采用RFLP方法進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同地理株的ITS1區(qū)域存在著差異，該差異與地緣遠(yuǎn)近有一定的關(guān)系。諸欣平等［14］用RFLP對分離自我國黑龍江的3株旋毛蟲進行蟲種歸屬鑒定并以國際標(biāo)準(zhǔn)蟲株作對照，結(jié)果顯示黑龍江豬株系T1，犬株為T2，貓株與T2相近。

2.4.2 隨機擴增多態(tài)性 DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD） RAPD是僅以一條單一的、由少數(shù)堿基組成的隨機核苷酸序列作為引物，該引物可在一個或多個位點上與基因DNA結(jié)合，所擴增的DNA片段在不同物種間顯示不同的多態(tài)性，可作為基因標(biāo)志用來對生物的種、株、型及種群進行鑒定區(qū)分。Pozio等［36］進行了RAPD方法檢測旋毛蟲的敏感性及特異性的相關(guān)試驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)單一幼蟲DNA完整時RAPD的敏感性為100%，當(dāng)幼蟲數(shù)量為4時，其特異性也可達(dá)到100%。劉明遠(yuǎn)等［15］以國際標(biāo)準(zhǔn)蟲種作對照，用RAPD技術(shù)，對中國不同地區(qū)和不同宿主分離的12株旋毛蟲進行擴增圖譜及遺傳數(shù)據(jù)聚類分析，顯示中國旋毛蟲豬株為T1，犬株和貓株為T2。

2.4.3 多重PCR（Multiplex PCR） 多重PCR是在一次反應(yīng)中加入多對引物，同時擴增1份DNA樣品的不同序列，根據(jù)擴增片段的長短不同，可判斷特定基因片段大小及是否存在缺失、突變。該技術(shù)操作簡單、可節(jié)省模板DNA、時間及費用。Zarlenga等［37］應(yīng)用多重 PCR 對6種蟲種（T1、T2、T3、T5、T7、T10）及1個基因型（T6）的r DNA 進行擴增，均出現(xiàn)特異性片段，該試驗僅需單條幼蟲即能清楚地區(qū)分基因相似的T6、T8和T3，并且具有較好的可重復(fù)性和可靠性。崔晶等［38］根據(jù)旋毛蟲rDNA擴展片段V區(qū)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因序列合成5對特異性引物，以國際參考株 T1、T2、T3、T4、T7作為對照，應(yīng)用多重PCR技術(shù)對我國6個豬源旋毛蟲地理株進行鑒定，結(jié)果顯示均具1條與T1相同的條帶，表明我國6個豬源旋毛蟲地理株均為T1。

2.5 分子遺傳學(xué) 通過選擇合適的分子標(biāo)記，測定核苷酸排列順序，分析DNA序列的差異及研究其系統(tǒng)進化關(guān)系，從而將不同的種、基因型或地理株區(qū)別開來。由于DNA相對穩(wěn)定，在分子水平進行系統(tǒng)發(fā)生研究具有基于表型分析研究無可比擬的優(yōu)勢，分析結(jié)果更加科學(xué)可靠。

目前用于DNA測序及種系發(fā)生研究的基因主要有細(xì)胞色素氧化酶1、線粒體r DNA大亞基片段（mt Lr DNA）、核糖體擴展片段V區(qū)（ESV）、核糖體5S r DNA 及18S r RNA。Pozio等［11］針對 ESV、CO1和mt Lr DNA對T11進行序列分析并與其它旋毛蟲蟲種進行序列比對，結(jié)果表明該蟲種與無包囊旋毛蟲T10同源性最大，與有囊旋毛蟲（T1、T2、T3、T4、T5、T7）同源性相對較小。La Rosa等［31］研究表明ESV在不同T4分離株中具有明顯的多態(tài)性，T4與T10間差異相對較大。Borsuk［39］等應(yīng)用線粒體r RNA（mt Lr DNA）為分子標(biāo)記對波蘭旋毛蟲進行序列分析，將波蘭境內(nèi)的旋毛蟲分為T1和T3兩類，認(rèn)為分析此基因的序列在鑒別T1和T3時具有較高的敏感性和可重復(fù)性。Bruyne等［40］選擇了高度保守的核糖體5S r DNA為分子標(biāo)記進行基因測序，鑒別了T3、T5和T7，認(rèn)為基于該分子標(biāo)記的序列分析方法可快速鑒定旋毛蟲蟲種。Fu BQ等［41］通過對中國10個豬犬旋毛蟲分離株的線粒體r DNA小亞基片段、ESV進行PCR擴增和對5S r DNA進行序列分析，結(jié)果顯示中國僅存在T1和T2兩個旋毛蟲種。Webb等［42］對T1和T5的線粒體基因組的全部蛋白編碼區(qū)（13 917 bp）和部分高度重復(fù)非編碼區(qū)（1 524 bp）應(yīng)用新一代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）進行分析，結(jié)果顯示T1和T5的基因組內(nèi)容和基因序列沒有顯著差異，估計整體種間差異僅為9.5%，但當(dāng)T1和T2每一個基因的變異量相比時，種間編碼區(qū)的平均變異量存在差異顯著。楊益超等［43］應(yīng)用5S r DNA序列分析，對廣西德保、南丹兩地旋毛蟲分離株進行鑒定，初步認(rèn)為廣西德保和南丹旋毛蟲分離株均為T1。李冬梅等［44］通過RT－PCR方法，克隆4個不同旋毛蟲隔離種的18S rRNA基因片段，并進行同源性分析，結(jié)果表明豬旋毛蟲為T1，犬旋毛蟲為T2。韓彩霞等［45］克隆了5個不同旋毛蟲隔離種的線粒體LS－rRNA基因片段，序列分析結(jié)果表明，犬旋毛蟲黑龍江隔離種與本地毛形線蟲T2的進化關(guān)系較近，豬旋毛蟲黑龍江隔離種和豬旋毛蟲美國隔離種與T1的進化關(guān)系較近，與傳統(tǒng)的分類學(xué)結(jié)果一致。

3 結(jié) 語

日前，隨著分子系統(tǒng)學(xué)的興起和發(fā)展，人們選用眾多的分子標(biāo)記應(yīng)用于物種的系統(tǒng)演化和分類研究，在選用不同的遺傳標(biāo)記對物種進行分類的過程中，得出的一些結(jié)果經(jīng)常與傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果不相符［13，15，16］，因此對旋毛蟲屬的分類目前尚不能單獨依靠分子生物和分子遺傳學(xué)方法，還需與形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等其它方法相結(jié)合才能確定一個新的蟲種，如幼蟲在宿主肌肉中不形成囊包和生活史中有鳥類的參與才是偽旋毛蟲區(qū)分旋毛蟲的主要標(biāo)準(zhǔn)。我國野生動物資源豐富，旋毛蟲屬也在不斷地進化及變異，因此我國是否還存在有其他種或基因型旋毛蟲，有待進一步調(diào)查研究?？傊?，旋毛蟲屬的分類方法更為可靠，依據(jù)更加充分，分類日益清晰，這就為旋毛蟲病的病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床學(xué)及預(yù)防研究奠定了重要基礎(chǔ)。

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