幾種畜禽病料采集技術(shù)

文│胡德武（江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)蔣王街道獸醫(yī)站）

馮太蘭（江蘇省揚(yáng)州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

采集檢測(cè)樣品是診斷檢測(cè)工作的重要內(nèi)容。采樣的時(shí)機(jī)是否適宜，樣品是否具有代表性，樣品處理、保存、運(yùn)送是否合適及時(shí)，與檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性關(guān)系極大。

一、畜禽病料采集技術(shù)

1.樣品采集的原則。

（1）適時(shí)采樣。根據(jù)檢測(cè)要求及檢測(cè)對(duì)象和檢驗(yàn)項(xiàng)目的不同，選擇適當(dāng)?shù)牟蓸訒r(shí)機(jī)十分重要。應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定時(shí)間采樣，有臨床癥狀需要作病原分離的，樣品必須在病初的發(fā)熱期或癥狀典型時(shí)采樣，病死的動(dòng)物應(yīng)立即采樣。

（2）合理采樣。根據(jù)診斷檢測(cè)的要求，除需嚴(yán)格按照規(guī)定采集各種足夠數(shù)量的樣品外，不同動(dòng)物疫病的需檢樣品各異，應(yīng)按可能的疫病側(cè)重采樣。對(duì)未能確定為何種疫病的，應(yīng)全面采樣。

（3）典型采樣。選取未經(jīng)藥物治療、癥狀最典型或病變最明顯的樣品，如有并發(fā)癥，還應(yīng)兼顧采樣。

（4）無(wú)菌采樣。采集檢驗(yàn)樣品除供病理組織學(xué)檢驗(yàn)外，還供病原學(xué)及血清學(xué)檢驗(yàn)的樣品，必須無(wú)菌操作采樣，采樣用具、容器均需無(wú)菌處理，尸體剖檢需采集樣品的，先采樣后檢查，以免人為污染樣品。

（5）適量采樣。采集樣品的數(shù)量要滿(mǎn)足診斷檢測(cè)的需要，并留有余地，以備必要時(shí)復(fù)檢。

（6）樣品處理。采集的樣品應(yīng)一種樣品一個(gè)容器，而且要立即密封，根據(jù)樣品性狀檢驗(yàn)要求的不同，作暫時(shí)的冷藏、冷凍或其他處理。供病毒學(xué)檢驗(yàn)的樣品，數(shù)小時(shí)內(nèi)要送到實(shí)驗(yàn)室，只作冷藏處理，超過(guò)數(shù)小時(shí)的要冷凍處理（凍結(jié)方法：可將樣品放入-30℃冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后再裝入有大小冰塊或干冰的冷藏瓶（箱）內(nèi)運(yùn)送，亦可將裝入樣品的容器放入隔熱保溫瓶?jī)?nèi)，再放入冰塊，然后每100克冰塊加入食鹽約35克，立即將隔熱保溫瓶瓶口塞緊。瓶?jī)?nèi)溫度可達(dá)-21℃左右）。供細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)或血清學(xué)檢驗(yàn)的樣品，冷藏送實(shí)驗(yàn)室即可。裝樣品的容器應(yīng)貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽要防止因凍結(jié)而脫落，標(biāo)簽標(biāo)明采集的時(shí)間、地點(diǎn)、號(hào)碼和樣品名稱(chēng)，并附上發(fā)病、死亡等相關(guān)資料，盡快送實(shí)驗(yàn)室。

（7）安全采樣。既要保護(hù)采樣人員，又要防止病原外泄，還要防止樣品受到污染。

（8）樣品包裝。主要是密閉，防止樣品損壞、污染和外泄等意外發(fā)生。

（9）迅速送檢。樣品應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，延誤送檢時(shí)間，會(huì)影響到檢測(cè)質(zhì)量和結(jié)果的可靠性。

2.血液樣品的采集。

（1）病毒檢驗(yàn)。病毒檢驗(yàn)用血液樣品，應(yīng)在動(dòng)物發(fā)病初體溫升高期采集。血液樣品必須是脫纖血或是抗凝血?？鼓齽┛蛇x用肝素或EDTA，枸緣酸鈉對(duì)病毒有輕微毒性，一般不宜采用。采血前，在真空采血管或其他容器內(nèi)按每毫升血液加入0.1%肝素1毫升或EDTA20毫克，采集的血液立即與抗凝劑充分混合，防止凝固。采脫纖血時(shí)，先在容器內(nèi)加入適量小玻璃珠，加入血液后，反復(fù)振蕩，以便脫去血液纖維。采集的血液經(jīng)密封后貼上標(biāo)簽，以冷藏狀態(tài)立即送實(shí)驗(yàn)室。必要時(shí)，可在血液中按每毫升加入青霉素和鏈霉素各500～1000國(guó)際單位，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

（2）細(xì)菌檢驗(yàn)樣品。采血應(yīng)在動(dòng)物發(fā)病初體溫升高或發(fā)病期，未經(jīng)藥物治療期間采集。血液應(yīng)脫纖或加肝素抗凝劑（或EDTA、枸緣酸鈉），但不可加入抗生素。采集的血液經(jīng)密封后貼上標(biāo)簽，以冷藏狀態(tài)立即送實(shí)驗(yàn)室，否則需置4℃冰箱內(nèi)暫時(shí)保存，但時(shí)間不宜過(guò)久，以免溶血。

（3）血清學(xué)檢驗(yàn)樣品。用作血清學(xué)檢驗(yàn)的樣品不加抗凝劑或脫纖處理。為保障血清質(zhì)量，一般情況下空腹采血較好。采集的血液貼上標(biāo)簽，室溫靜置待凝固后送實(shí)驗(yàn)室，并盡快將自然析出的血清或經(jīng)離心分離出的血清吸出，按需要分裝，再貼上標(biāo)簽冷藏保存?zhèn)錂z。較長(zhǎng)時(shí)間才檢驗(yàn)的，應(yīng)凍結(jié)保存，但不能反復(fù)凍融，否則抗體效價(jià)下降。作血清學(xué)檢驗(yàn)的血液，在采血、運(yùn)送、分離血清過(guò)程中，應(yīng)避免溶血，以免影響檢驗(yàn)結(jié)果。采集雙份血清檢測(cè)比較抗體效價(jià)變化的，第一份血清采于發(fā)病的初期并作凍結(jié)保存，第二份血清采于第一份血清后3～4周，雙份血清同時(shí)送實(shí)驗(yàn)室。

（4）寄生蟲(chóng)檢驗(yàn)樣品。因不同的血液寄生蟲(chóng)在血液中出現(xiàn)的時(shí)機(jī)及部位各不相同，因此需要根據(jù)各種血液寄生蟲(chóng)病的特點(diǎn)，取相應(yīng)時(shí)機(jī)及部位的血液制成血涂片，送實(shí)驗(yàn)室。

3.組織樣品的采集。組織樣品一般從撲殺動(dòng)物或病死尸體中采集。從尸體采樣時(shí)，先剝?nèi)?dòng)物胸腹部皮膚，以無(wú)菌器械將腹腔打開(kāi)，根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蛣?dòng)物生前疫病的初步診斷，無(wú)菌采集不同的組織。

（1）病毒檢驗(yàn)樣品。作病毒檢驗(yàn)的組織，必須以無(wú)菌技術(shù)采集，組織應(yīng)分別放入滅菌的容器內(nèi)并立即密封，貼上標(biāo)簽，放入冷藏容器立即送實(shí)驗(yàn)室。如果時(shí)間較長(zhǎng)，可作凍結(jié)狀態(tài)運(yùn)送，也可將組織塊浸泡在pH7.4左右的乳漢液或磷酸緩沖肉湯保護(hù)液內(nèi)，并按每毫升保護(hù)液加入青霉素、鏈霉素各1000國(guó)際單位，然后放入冷藏容器，送實(shí)驗(yàn)室。

（2）細(xì)菌檢驗(yàn)樣品。供細(xì)菌檢驗(yàn)的組織樣品，應(yīng)新鮮并以無(wú)菌技術(shù)采集。如尸體已經(jīng)腐敗，某些疫病的致病菌仍可采集于長(zhǎng)骨或肋骨，從骨髓中分離細(xì)菌。采集的所有組織分別放入滅菌的容器內(nèi)并立即密封，貼上標(biāo)簽，放入冷藏容器立即送實(shí)驗(yàn)室。

4.糞便樣品的采集。

（1）病毒檢驗(yàn)樣品。分離病毒的糞便必須新鮮。少量采集時(shí)，以滅菌的棉拭子從直腸深處或泄殖腔黏膜上蘸取糞便，并立即投入滅菌的試管內(nèi)密封，或在試管內(nèi)加入少量pH7.4的保護(hù)液再密封，貼上標(biāo)簽冷藏送實(shí)驗(yàn)室。

（2）細(xì)菌檢驗(yàn)樣品。作細(xì)菌檢驗(yàn)的糞便，最好在動(dòng)物使用抗菌藥物之前，從直腸或泄殖腔黏膜上采集，采樣方法與供病毒檢驗(yàn)的相同?？赏度胧⒂袩o(wú)菌緩沖鹽水或肉湯的指形管內(nèi)，貼上標(biāo)簽冷藏送實(shí)驗(yàn)室。

（3）寄生蟲(chóng)檢驗(yàn)樣品。糞便樣品應(yīng)選取新排出的或直接從直腸內(nèi)采得，以保持蟲(chóng)體、蟲(chóng)體節(jié)片及蟲(chóng)卵的固有形態(tài)，一般寄生蟲(chóng)檢驗(yàn)的糞便用量較多。采得的糞便以冷藏不凍結(jié)狀態(tài)送實(shí)驗(yàn)室。

二、幾種畜禽疫病的樣品采集

1.口蹄疫樣品的采集、保存和運(yùn)送?？谔阋卟《驹诓⌒蟮乃捚?nèi)及其淋巴液中含毒量最高。在水皰發(fā)展過(guò)程中，病毒進(jìn)入血流，分布到全身各種組織和體液中。發(fā)熱期血液內(nèi)的病毒含量最高，退熱后奶、尿、口涎、淚、糞便等都含有一定量的病毒。

（1）組織樣品。樣品的選擇：用于病毒分離、鑒定的樣品以發(fā)病動(dòng)物（牛、羊或豬）未破裂的水泡皮和水泡液為最好。對(duì)臨床健康但懷疑帶毒的動(dòng)物可在撲殺后采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品作為檢測(cè)材料。

樣品的采集和保存：樣品采集部位可用清水清洗（切忌使用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭），剪取病畜的新鮮水泡皮3～5克放入滅菌小瓶中，加適量50%甘油—磷酸鹽緩沖液（pH7.4），加蓋密封；也可采用無(wú)菌器具采集水泡液至少1毫升，裝入滅菌小瓶中（可加適量抗菌素），加蓋密封盡快冷凍保存。在無(wú)法采集水泡皮和水泡液時(shí)，可采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品3～5克裝入潔凈小瓶?jī)?nèi)，加蓋密封盡快冷凍保存。樣品的包裝瓶上均要貼上標(biāo)簽，寫(xiě)明采樣地點(diǎn)，動(dòng)物種類(lèi)，編號(hào)，時(shí)間等。

（2）牛、羊食道—咽部分泌物（O—P液）樣品。樣品采集：被檢動(dòng)物在采樣前禁食（可飲水）12小時(shí)，以免胃內(nèi)容物反流污染O—P液。采樣探杯在使用前經(jīng)0.2%檸檬酸或2%氫氧化鈉浸泡5分鐘，再用潔凈水沖洗。每采完一頭動(dòng)物，探杯要重復(fù)進(jìn)行消毒并充分清洗。采樣時(shí)動(dòng)物站立保定，將探杯隨吞咽動(dòng)作送入食道上部10～15厘米處，輕輕來(lái)回移動(dòng)2～3次，然后將探杯拉出。

樣品的保存：將采集到的8～10毫升O—P液倒入25毫升以上的滅菌玻璃容器中，容器中應(yīng)事先加有8～10毫升細(xì)胞培養(yǎng)液或磷酸緩沖液（0.04摩爾／升、pH7.4），密封后充分搖勻并盡快冷凍保存，用于病原檢測(cè)，做出追溯性診斷。

（3）血清。懷疑曾有疫情發(fā)生的畜群，錯(cuò)過(guò)組織樣品采集時(shí)機(jī)時(shí)，可無(wú)菌操作采集動(dòng)物血液，每頭不少于10毫升。無(wú)菌分離血清裝入滅菌小瓶中，加蓋密封后冷藏保存，通過(guò)檢測(cè)抗體，做出追溯性診斷。

采集樣品時(shí)要填寫(xiě)樣品采集登記表。裝樣玻璃容器必須密封，需加貼防水標(biāo)簽。樣品運(yùn)送前將樣品玻璃容器裝入金屬套筒中，套筒應(yīng)填充防震材料，加蓋密封，與采樣記錄一同裝入專(zhuān)用運(yùn)輸容器中。專(zhuān)用運(yùn)輸容器應(yīng)隔熱堅(jiān)固，內(nèi)裝適當(dāng)冷凍劑和防震材料。外包裝上要加貼生物安全警示標(biāo)志。

2.禽流感的樣品采集、保存和運(yùn)輸。病毒主要在呼吸道黏膜細(xì)胞內(nèi)增殖。

（1）病禽。至少?gòu)?只瀕死禽采集樣品。樣品包括：泄殖腔拭子和氣管拭子（置于緩沖液中）各5個(gè)（小珍禽可采集新鮮糞便）；氣管和肺的混樣5個(gè)，腸管及內(nèi)容物的混樣5個(gè)；肝、脾、腎和腦等組織樣品（不能混樣）各5個(gè)。

采集方法：泄殖腔棉拭子：將棉拭子插入肛門(mén)并旋轉(zhuǎn)，使糞便沾在拭子上，后放在運(yùn)輸緩沖液中。氣管棉拭子：活雞采樣時(shí)，將棉拭子插入活雞的氣管內(nèi)，輕輕擦拭氣管壁并放入緩沖液中。死亡動(dòng)物采氣管樣品時(shí)，可在肺和氣管離體情況下進(jìn)行采集，應(yīng)將棉拭子插入較深部位用力擦拭，并按上述方法將棉拭子放在運(yùn)輸緩沖液中。糞便樣品：可采取新鮮糞便，用棉拭子蘸取糞便，并將采好的樣品放在運(yùn)輸緩沖液中。

分別采集至少10個(gè)病禽的血樣（急性發(fā)病期血清）。采集時(shí)使用一次性采血器，心臟或翅靜脈采血，每只禽采血樣2～3毫升，經(jīng)離心或自然析出血清后，將血清移到指形管中，封口，并貼好標(biāo)簽。不同禽只的血樣不能混合。

（2）病死禽。無(wú)發(fā)病禽時(shí)，可從死亡不久的病禽采樣，采樣要求同病禽。棉拭子單獨(dú)放入容器，容器中盛放含有抗菌素的PH值為7.0～7.4的磷酸鹽緩沖液?？股氐倪x擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中加入青霉素（2000國(guó)際單位／毫升）、鏈霉素（2000國(guó)際單位／毫升）、慶大霉素（50微克／毫升）、制霉菌素（10000國(guó)際單位／毫升）。但糞便和泄殖腔拭子所用的抗生素濃度應(yīng)提高5倍。加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.4。

（3）樣品的保存和運(yùn)輸。血樣要單獨(dú)存放，不能混合；樣品應(yīng)密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷劑的容器中運(yùn)輸，容器必須密封，防止?jié)B漏；樣品若能在24小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，冷藏運(yùn)輸。否則，應(yīng)冷凍運(yùn)輸。若樣品暫時(shí)不用，則應(yīng)冷凍（最好-70℃或以下）保存。

3.豬瘟樣品的采集。豬瘟病毒復(fù)制的主要部位是扁桃體，然后經(jīng)淋巴管進(jìn)入淋巴結(jié)，繼續(xù)增殖，隨即到達(dá)外周血液，從這時(shí)起病毒在脾、骨髓、內(nèi)臟淋巴結(jié)和小腸的淋巴結(jié)組織繁殖到高滴度。樣品包括：全血、骨髓、淋巴結(jié)、扁桃體、腎臟、脾臟。

4.新城疫樣品的采集。新城疫病毒存在于病雞所有器官、體液、分泌物和排泄物，以腦、脾和肺含毒量最高，骨髓含毒時(shí)間最長(zhǎng)。樣品包括：眼分泌物、泄殖腔拭子、脾臟、氣管黏膜、腦等。