豬傳染性胸膜肺炎疫苗的研究進展

喻明成，湯德元，李春燕，王 鳳，王 彬，張曉杰，甘振磊

（1.貴州省開陽縣草地生態(tài)畜牧業(yè)發(fā)展中心，貴州 開陽 550300，2.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的高度接觸性呼吸道疾病。該病主要以肺出血、壞死和纖維素性滲出為病變特征?？芍赂髂挲g段的豬發(fā)生急性和慢性感染，常與巴氏桿菌等混合感染。臨床特征為：病豬發(fā)熱(體溫可達42 ℃)，食欲不振，呼吸困難，后期呈犬坐姿勢、張口伸舌、咳喘、腹式呼吸。耳、鼻、眼及后軀皮膚發(fā)紺；剖檢可見纖維素性胸膜肺炎，尤其是肺兩側，65%的肺葉病變嚴重；發(fā)病率和死亡率常在20%以上，最急性型的死亡率可高達80%～100%；慢性型豬傳染性膜肺炎放線桿菌潛伏于豬體內，可使豬只生長緩慢，平均日增重下降，飼養(yǎng)報酬降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。同時，急性感染耐過或陰性感染的豬只將是帶菌者，成為本病再次暴發(fā)和流行的潛在傳染源，是本病防控和根除的隱患。另外，感染APP后的仔豬，由于胸椎間膿腫壓迫脊髓而引起后軀麻痹。

由于胸膜肺炎放線桿菌血清型較多，不同地區(qū)和豬場流行的血清型不盡相同，我國流行的優(yōu)勢血清型主要是1、2、3和7型。各血清型之間很少有交叉免疫保護作用，在防治本病的工作中，藥物防治容易產生耐藥性且成本較高，控制后極易復發(fā)，而且細菌不斷產生耐藥性，大量使用抗生素還會導致藥物殘留，影響食品安全。因此，研制安全高效的疫苗對預防和控制該病具有十分重要的意義。本文主要針對有關豬傳染性胸膜肺炎疫苗研究的進展進行綜述。

1 滅活疫苗

是豬傳染性胸膜肺炎的傳統疫苗，一般是用當地分離的優(yōu)勢流行菌株進行培養(yǎng)，通過加熱或福爾馬林處理使細菌滅活后加入適當的佐劑研制而成。它的優(yōu)點是安全、不存在散毒和造成新疫源的危險，也不會返祖返強，便于貯存和運輸。目前，用于預防豬傳染性胸膜肺炎的商品化疫苗大多是這種疫苗。逯忠新等以國內多發(fā)的APP血清1、3和7型強毒株作為制苗菌株，制成油佐劑三價滅活苗。經效力試驗，對上述3種血清型強毒攻擊的保護率分別為88.8%、88.8%和100%。經試驗動物安全性檢驗及田間安全檢驗，除個別豬出現輕微體溫反應及暫時減食外，無其他異常反應，表明該疫苗對豬的保護性及安全性良好。

盡管滅活苗在國內運用得非常廣泛，但它有許多缺點：如需多次免疫且保護效果非常有限；由于APP血清型眾多，滅活苗僅能給免疫豬提供針對同一血清型菌株感染的抵抗力，甚至同型間有時也不能提供完全的交叉保護等，這些缺點給免疫預防該病帶來了極大的困難。因此，研究安全、新型和能提供有效交叉保護力的APP疫苗是預防和控制該病的重要手段。

2 弱毒疫苗

研究表明，絕大多數APP滅活苗只能降低由于APP感染所引起的死亡率，并不能完全排除菌體以及阻止慢性感染造成的肺部損傷。研究者發(fā)現，自然感染某一血清型APP并且耐過的豬只能抵抗該血清型APP的再次感染。這就提示人們研制APP弱毒疫苗來免疫豬，可能獲得高效的保護。近20年來，人們對APP的弱毒疫苗進行了大量研究，取得了一定的研究進展。

2.1 莢膜缺失弱毒疫苗

Rosendal和Maclnnes(1990)將一株血清1型APP在體外傳代70次，使其莢膜變薄，而其他成份如外膜蛋白、全菌蛋白、Apx毒素都未發(fā)生變化，結果莢膜變薄的菌株毒力減弱但仍具有一定的免疫效果。Inzana1993)用甲磺酸乙酯對APP進行誘變，得到莢膜完全消失的突變菌株，該突變菌株的LPS（脂多糖）、膜蛋白以及Apx毒素都和親本株相同，但毒力卻大為減弱。不僅如此，突變菌株免疫動物，可產生很好的保護力，用同型或異型的血清型APP對免疫動物進行攻毒，均不會出現臨床癥狀。莢膜只有很弱的免疫保護性，但莢膜卻為APP的毒力所必需。所以莢膜缺失的菌株在毒力減弱的同時，并不影響其保護力。然而Inzana采用化學方法使莢膜缺失的菌株存在表型回復的可能，這是莢膜缺失弱毒疫苗一個潛在的安全問題。

2.2 毒素缺失弱毒疫苗

Bei等（2005)通過同源重組和蔗糖負向篩選系統，在血清7型APP的毒素ApxⅡC基因中插入綠熒光蛋白基因(GFP)使之失活，得到了一個不含抗性基因但能表達ApxⅡA的突變株。突變株的毒力在小鼠中大為降低，免疫小鼠后能對同型攻毒提供100%的保護，對異型攻毒提供70%的保護。Xu(2006)以血清10型APP為基礎，插入氯霉素抗性基因同時缺失ApxlA基因編碼C端的片段，構建了能夠提供潛在的交叉保護的突變株。突變株分泌大約ApxI-N端48 ku的蛋白，失去了溶血活性，在小鼠中的毒力大為降低。該突變株免疫豬后，以異源血清9型APP攻毒，在臨床癥狀、肺損傷上能提供一定的交叉保護。Lin(2007)以血清1型APP分離株為親本菌株，通過同源重組和負向篩選的方法分步缺失了ApxI和ApxⅡ的激活因子ApxⅠC和ApxⅡC，構建不含抗性標記的APP雙基因缺失株，該突變株毒力低，免疫原性好，免疫動物可對同源血清1型APP和異源血清9型APP的攻擊提供有效保護。同時，該研究還比較了鼻腔接種和肌肉注射2種免疫方式效果，結果鼻腔接種效果明顯優(yōu)于肌肉注射免疫。

2.3 溫度敏感型弱毒疫苗

Byrd和Hooke(1997)用亞硝基胍誘變、青霉素和環(huán)絲氨酸富集的方法，篩選了血清1型APP溫度敏感型弱毒菌株，其生化特性、LPS（脂多糖）、外膜蛋白和Apx毒素都與親本菌株相同，但在37 ℃的條件下，細菌復制1～3代就會死亡。用溫敏突變株通過鼻內免疫小鼠，對5×LD50的親本菌株攻擊具有部分保護力。與先前Inzana(1993)研制的莢膜突變株比較，該突變株毒力更低，反強危險也相對較低。但是，該突變株仍然具有反強可能，暫時不能作為疫苗開發(fā)，還需要進一步改造溫敏突變株，使之能穩(wěn)定遺傳。Byrd還評價了莢膜、LPS、OMP（造骨牛奶蛋白）和毒素蛋白的抗體水平和保護性之間的關系。結果發(fā)現莢膜多糖和LPS的抗體水平和保護性不相關，抗體水平在不同的感染程度間沒有區(qū)別，但毒素的抗體水平和保護性之間呈正相關，從而證明毒素的抗體水平在保護中起著極為重要的作用。

2.4 生物合成基因缺失弱毒疫苗

Fuller等(1996)通過缺失核黃素生物合成操縱子(ribGBAH)一部分基因后，用含有卡那霉素抗性基因表達盒來取代這部分基因，利用同源重組技術獲得了核黃素合成酶突變株，該突變株與親本菌株相比毒力明顯降低，構建了APP第1個編碼代謝物基因缺失的突變菌株，同時也是首次報道核黃素合成必需基因缺失后能夠導致病菌的毒力降低，有望把它作為弱毒疫苗候選菌株進一步研究。隨后他在2000年通過試驗證實，將這種弱毒突變株以肌肉接種免疫動物可產生顯著的免疫保護力，可以抵抗APP野毒的攻擊。Ingham等(2002)利用插入失活，通過氨芐抗性基因表達盒的插入獲得了aroQ(5烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合酶)失活的血清l型APP致弱株，由于aroQ基因缺失株在體內的生存能力較差，其在動物體內的毒力也就大大降低。通過質?；パa試驗可以恢復突變株在體內的生存能力，故該突變株有望發(fā)展成為一個細菌疫苗載體，表達其他豬呼吸道疾病的免疫源性基因。

2.5 多基因缺失弱毒疫苗

隨著研究的深入開展，人們對弱毒疫苗的要求也越來越高。由于APP毒力因子眾多，所以多個毒力因子缺失的突變株顯然比單基因突變株的毒力要降低得更多，而且發(fā)生回復突變的可能性也更小。因此，多基因突變的弱毒疫苗是當前疫苗發(fā)展的方向。Oswald等(1999)發(fā)展了一種有效定點突變系統，可以把不含標記的缺失基因引入到APP中。通過這種方法，構建了脲酶基因(ureC)和與鐵攝取相關的基因(exb)的突變株。這種方法也使在APP中構建多基因缺失突變株成為可能。Maas等(2006)在Tonpitak(2002)構建的血清2型APP弱毒株的基礎上，繼續(xù)缺失了一系列的毒力相關因子，包括3個與厭氧呼吸相關的酶類dmsA，hybB，aspA和鐵攝取調節(jié)基因fur，得到了高度致弱的6基因缺失株。該6基因缺失株可以在下呼吸道克隆并誘導出可檢測免疫應答，免疫動物后產生了對異源血清9型APP攻擊的有效保護。最重要的是，由于apxⅡA基因的缺失，該疫苗還可以用ApxⅡA-ELISA鑒別區(qū)分自然感染動物和疫苗免疫動物，因而可用作鑒別診斷。

利用現代分子生物學技術和基因工程方法，研究不含抗生素標記基因、可以區(qū)分自然感染豬和疫苗免疫豬、低毒力或無毒力的APP基因工程活疫苗菌株并研制成疫苗，是弱毒疫苗研究的一個發(fā)展方向，已成為目前控制豬傳染性胸膜肺炎疫苗研究的熱點領域。然而，對于APP的致病機制，至今也未能得到完全闡述，所以獲得絕對低毒菌株、高效保存方法和便捷接種途徑等難題仍然困擾著人們，由此可見APP的弱毒疫苗的研究任重而道遠。

3 亞單位疫苗

隨著對APP毒力因子致病性和免疫原性的研究不斷深入，人們認為全菌體滅活疫苗保護力不夠是因為這種疫苗不包含APP生長過程中分泌到外界的一些毒力因子，特別是Apx毒素，因而開始著手研究與毒力因子相關的亞單位疫苗，以期提高疫苗的保護效果。如用一些與致病有關的蛋白如莢膜、外膜蛋白、溶血素以及多種免疫原的混合物來制備亞單位苗。研究發(fā)現將APP的2種或2種以上的毒力因子混合，如莢膜多糖與脂多糖、轉鐵結合蛋白與脂蛋白、ApxⅠ與ApxⅡ、ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ與OMP等進行免疫攻毒保護試驗均獲得有效的保護。

Rapp等(1986)研究表明，用富含外膜脂蛋白的制劑(OmlA)免疫動物后，對同種血清型APP的感染，具有一定的保護力。Chiang等(1991)發(fā)現用蛋白酶-K處理后的外膜蛋白免疫動物，保護效果更好。Devenish等(1990)研究發(fā)現，110 ku的溶血素是一種重要的免疫原，刺激機體產生的抗體水平和保護力呈正相關。其后Fedorka-Cray(1990)的研究表明，血清1型APP的細胞抽提物的保護力比滅活苗和外膜脂蛋白的制劑更好。他推測，OmlA與細胞抽提物聯合免疫動物，將會產生更好的保護力。Fedorka-Cray等1993年進一步研究了細胞抽提物(主要成分為ApxI和ApxII)的保護效果，并和4種滅活疫苗免疫效果進行了對比試驗，結果顯示細胞抽提物可以顯著降低肺部病變率和阻止死亡，認為這種細胞抽提物包含可以完全保護同型菌攻擊發(fā)病和死亡的物質。

Maas等(2006)發(fā)展了一種可以用于鑒別診斷的亞單位疫苗(DIVA)，它結合了先前研究的優(yōu)點，在鐵離子限制條件下培養(yǎng)用血清l、2和5型APP apxⅡA缺失體，取細胞抽提物乳化，包含主要的膜蛋白和分泌性蛋白。以同源血清2型APP攻毒，免疫組沒有表現胸膜肺炎臨床癥狀，細菌分離率也顯著低于對照組。以異源血清9型菌APP攻毒，免疫組肺組織沒有損傷，僅有2頭(共10頭)豬的肺組織可分離到少量的攻毒菌株。免疫組不產生針對ApxⅡA的抗體。因此，該疫苗免疫動物可以和野毒感染動物區(qū)分。該結果表明，多種表面抗原的抗體是產生良好交叉保護的原因，而單一的重組蛋白或僅含毒素加外膜蛋白的亞單位疫苗免疫效果很有限，無法阻止細菌定殖和肺部病灶形成。

以上研究表明，Apx毒素對于異源血清型APP的攻擊是很重要的一種毒力因子，但是它并不是提供免疫力唯一毒力因子，因為僅僅含有Apx毒素的亞單位疫苗也只能提供部分保護。同時亞單位疫苗需要多次注射，通過物理和化學方法提取、純化和制備亞單位疫苗成本高，價格昂貴。但它的最大優(yōu)點是使用時不必檢測患豬的血清型，可以在全世界通用。

4 Ghosts疫苗

滅活疫苗作為一種“死”苗，雖然具有最好的安全性。但由于在滅活過程中，某些抗原的免疫原性會遭到破壞，影響其免疫保護效果。近年來，APP的一種新的“死”苗—Ghosts疫苗的研究引起很多人的興趣。這種疫苗實際上是細菌的空殼，它是利用噬菌體ΦXl74的E基因在革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌、肺炎桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、胸膜肺炎放線桿菌)中表達后，在菌體上形成一個通道，使細菌的DNA及細胞質都流失到體外，最終引起細菌的裂解失活而制備的一種疫苗。通過控制噬菌體ΦXl74的E基因表達來生產整個菌體衣殼，該方法制備的疫苗由于在制作過程中沒有經過劇烈的物理或化學滅活過程。這些空的菌體衣殼具有與活細菌功能一樣的抗原決定簇，從而具備良好的免疫原性，可以誘導產生較好的免疫保護效果。

Jalava等認為：Ghosts疫苗利用細胞膜定向載體，可把外源基因定向黏附到細胞膜上，可作為重組疫苗或多價疫苗的載體，而且插入的外源蛋白抗原決定簇基因不受大小的限制；Ghosts疫苗可以大量生產，且價格低廉；重組體Ghosts疫苗儲存方便，能長期常溫保存。對實驗動物進行腹腔內、皮下、肌肉注射均可以激發(fā)特異的體液和細胞免疫應答；Ghosts疫苗成份，如肽聚糖也可作為天然免疫佐劑，外源靶蛋白與Ghosts疫苗混合后，Ghosts疫苗的組分對靶蛋白似乎有著優(yōu)于明礬和完全弗氏佐劑的佐劑效應。但是，Ghosts疫苗仍然存在滅活不徹底的缺點，需要克服后才能在生產中應用。

不同動物中的免疫分析表明，該疫苗不僅可激發(fā)體液免疫應答，還可激發(fā)細胞免疫應答。但該疫苗作為一種“死”苗，同滅活疫苗一樣同樣缺乏菌體在生產過程中分泌的外毒素，而外毒素在交叉免疫保護中的重要作用已經得到證實。因此，其在交叉保護方面可能受到一定的影響。

5 口服疫苗

目前APP的疫苗一般是采用肌肉注射的方法進行免疫。免疫接種操作困難，而且肌注普通的細菌滅活苗往往對注射部位造成損傷，易引起豬群緊張，伴隨炎癥反應、機體發(fā)熱等副作用，特別是對于仔豬往往造成很大傷害。研究發(fā)現，與其他呼吸道病原菌一樣，APP也是通過黏膜侵入宿主。研究表明使用口服疫苗能夠誘導很高的免疫反應，當第2次免疫時加大l0倍的劑量，動物能夠克服免疫耐受，維持很高水平的全身免疫。于是人們開始嘗試開發(fā)一種能誘導黏膜免疫反應的APP口服疫苗。

微膠囊技術是當今發(fā)展迅速、用途廣泛的一種技術。它是將固體、液體或氣體包裹在一個微小的膠囊中，形成微膠囊的物質。由于與外界環(huán)境隔離，可以免受外界環(huán)境的影響而保持穩(wěn)定，在適當條件下，被包封物質又可以釋放出來。Liao等(2001)利用乙基纖維素包覆技術，將滅活后血清1型APP包覆于微膠囊中，將這種腸溶性微膠囊口服疫苗以灌胃方式接種小鼠，然后進行抗體檢測，發(fā)現小腸產生了很高的黏膜IgA抗體，但與滅活苗相比，口服腸溶性微膠囊疫苗產生的IgG抗體較低。隨后Liao等(2003)利用豬和小鼠對這種疫苗的保護性作了進一步研究，并與普通的全細菌滅活苗進行對比，發(fā)現調整免疫劑量和時間后，微膠囊口服疫苗所產生的菌體抗體和黏膜IgA抗體均比全細菌滅活苗高，而且同型APP攻毒后產生的保護也比全細菌滅活苗好。因此，不斷改進的微膠囊口服疫苗有望成為一種預防豬傳染性胸膜肺炎的新型疫苗。

釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是一種優(yōu)良的表達系統，和大腸桿菌相比，表達的蛋白更接近天然蛋白而保持更好的免疫活性。Yoo等(2003)首先克隆了ApxⅡA基因并在釀酒酵母和煙草中表達，免疫小鼠后能對APP的攻毒提供一定的保護力，且抗ApxⅡA的免疫球蛋白IgA和IgG效價上升與免疫時的口服劑量呈正相關，這表明黏膜和體液免疫力可由口服疫苗誘導產生。同樣，Shin等(2005)利用啤酒酵母系統表達了APP ApxⅡA蛋白后發(fā)展了一種口服疫苗。小鼠試驗進一步證實，表達蛋白具有很好免疫原性；通過檢測ApxⅡA特異性的IgA和IgG抗體，證實了這種口服疫苗可以誘導有效的黏膜和體液免疫反應。

6 核酸疫苗

核酸疫苗又稱基因疫苗或DNA疫苗，是將一種或多種抗原編碼基因克隆到真核表達載體上，以構建的重組質粒直接注入到體內而激活機體免疫系統。因此，也有人稱之為DNA免疫。核酸疫苗作為一種新型疫苗在結核分枝桿菌有成功試驗報道。貝為成等(2005)對胸膜肺炎放線桿菌的核酸疫苗進行了初步研究，構建了ApxⅡA的真核表達質粒，可以在PK-15細胞中表達ApxⅡA并具有良好免疫原性。以該質粒肌肉注射免疫Balb／C小鼠(近交系小鼠)，可以產生較高水平的ELISA抗體，初步證實用ApxⅡA作為核酸疫苗免疫動物可以激活機體免疫應答反應。

7 異源疫苗

異源疫苗是指利用不同微生物菌(毒)株，制備疫苗，接種后能使其獲得對疫苗中不含有的病原體產生抵抗力，或是用同一種類病原中的一種型制備疫苗來抵抗另一型病原體，如火雞皰疹病毒疫苗預防雞馬立克氏病，兔纖維瘤病毒疫苗能使其抵抗兔黏液瘤病毒。該方法制備疫苗的理論根據是:異源疫苗含有類屬抗原，故能產生交叉免疫。另外，異源疫苗進入機體后，能迅速被消滅，散毒危險小，所以這類疫苗在實踐中非常有意義。Lei等(2008)對APP血清l、5型(CCVC259，CCVC263)基因組進行分析研究，構建其基因文庫，對血清1型6個候選疫苗蛋白基因和血清5型13個基因片段進行抗原性分析，發(fā)現其中的8個基因片段與短小棒狀桿菌核苷酸同源性在77%～100%。采用短小棒狀桿菌免疫小鼠后，用10×LD50的APP血清l、5型菌株分別進行攻毒試驗，保護率分別達90%和95%。采用短小棒狀桿菌免疫豬群，能夠誘導豬群產生高水平抗APP的交叉反應血清抗體(滴度高達1∶6400)，同時免疫豬群可抵抗高劑量APP攻擊。試驗結果表明，APP與短小棒狀桿菌之間存在共同抗原，這種交叉保護的重點在于使用短小棒狀桿菌免疫接種可用于防治APP感染，成為防治APP的新型疫苗。

疫苗研制的最佳構想應該包括安全、有效、多價、成本低及保存和使用方便等，但豬傳染性胸膜肺炎的疫苗要達到這一目標還需要一個漫長的過程。PCP疫苗的研究已經取得了一些可喜的進展，隨著人們對病毒致病原認識的不斷深入，研制的PCP疫苗也在不斷完善，相信不久的將來科學家們會研制出特別有效的疫苗來控制PCP的發(fā)生。

（參考文獻略）