兩種培養(yǎng)基對(duì)黃花蒿揮發(fā)油體外抑菌活性的研究

高志玲 樊 偉

（1 白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 白城 137000；2 白城市第一中學(xué)，吉林 白城 137000）

黃花蒿（Artemisia annua L.），為一年生草本植物，在全國各省份均有分布，是一種傳統(tǒng)中草藥。用于暑邪發(fā)熱、陰虛發(fā)熱、夜熱早涼、骨蒸勞熱、瘧疾寒熱、濕熱黃疸等證[1]。黃花蒿的主要有效成分為青蒿素和揮發(fā)油等，過去的研究主要集中在青蒿素上[2]，對(duì)揮發(fā)油的研究很少。本實(shí)驗(yàn)采用了普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和抗生素實(shí)驗(yàn)用的M-H培養(yǎng)基初步研究了黃花蒿揮發(fā)油的體外抑菌活性，以期為黃花蒿的綜合利用和天然食品防腐劑的開發(fā)提供參考，同時(shí)探討兩種不同培養(yǎng)基對(duì)中藥抑菌活性的檢測(cè)效果。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品來源

野生黃花蒿采自吉林省白城市近郊，經(jīng)東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院肖洪興教授鑒定為菊科植物（Artemisia annua L.）。

1.2 菌種來源

枯草桿菌（Bacillus subtilis）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）、變形桿菌（proteusbacillus vulgaris）、糞鏈球菌（Fecal streptococcus）均由白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 儀器

BB89-2000揮發(fā)油提取器：北京中西泰安技術(shù)服務(wù)有限公司；AY220電子天平：日本島津公司；78-1型電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；MLS3750型高壓蒸汽滅菌器：SANYO；YJ-875型醫(yī)用超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司。

2 方 法

2.1 黃花蒿揮發(fā)油的制備

取黃花蒿全草的鮮品，水蒸氣蒸餾法提取得到淡黃色油脂，即為黃花蒿揮發(fā)油。黃花蒿揮發(fā)油用吐溫80乳化，再溶解于一定體積的水中，配制成3.125～50.0mg/mL不同濃度的溶液，于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 培養(yǎng)基制備

①營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備:稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂22.5g加500mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌20min備用。②M-H瓊脂培養(yǎng)基制備:稱取16.5gM-H瓊脂加500mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌20min備用。

2.3 紙片法測(cè)定抑菌效果

用打孔器將干凈的濾紙制成直徑為0.5cm的小圓紙片，干熱滅菌后，分別浸入不同濃度的溶液中，使其充分吸收，備用。在超凈臺(tái)里用無菌的1mL移液管吸取菌懸液1滴置于倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，涂布均勻。將浸泡處理過的濾紙片瀝干，貼在上述含菌平板上，每個(gè)平板貼3片相同黃花蒿揮發(fā)油濃度的濾紙片。吐溫80和無菌水的混合液作為空白對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18h，測(cè)量抑菌圈的直徑。每個(gè)培養(yǎng)皿上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

2.4 試管法測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）

根據(jù)濾紙片法所得的結(jié)果，參照文獻(xiàn)[3]，采用試管法對(duì)各受試菌種進(jìn)行最低抑菌濃度測(cè)定（MIC）。兩種培養(yǎng)基分別以每管總體積5mL分裝于試管中，121℃，0.1Mpa條件下滅菌20min。當(dāng)滅菌培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，加入黃花蒿揮發(fā)油，倍比稀釋成0.3125～20.0mg/mL梯度濃度，充分混勻，無菌水做對(duì)照，分別制成斜面。取生長(zhǎng)良好的受試菌劃線接種于斜面上。置于37℃溫箱中培養(yǎng)，觀察24h菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。取完全不生長(zhǎng)管最低樣品濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同質(zhì)量濃度黃花蒿揮發(fā)油抑菌效果

用吐溫80和無菌水配制50.0mg/mL、25.0mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL的揮發(fā)油溶液，采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定黃花蒿揮發(fā)油在兩種培養(yǎng)基上的抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃花蒿揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)菌均有明顯的抑制作用，隨著質(zhì)量濃度的增大，抑菌效果均呈上升趨勢(shì)。在50.0mg/mL時(shí)，四聯(lián)球菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、變形桿菌在普通培養(yǎng)基上的抑菌圈直徑分別是9.8mm、10.6mm、9.2mm、7.2mm，在M-H培養(yǎng)基上的抑菌圈直徑分別是10.5mm、11.3mm、10.8mm、8.5mm，黃花蒿揮發(fā)油對(duì)革蘭陽性菌（四聯(lián)球菌、糞鏈球菌和枯草桿菌）的生長(zhǎng)有明顯的抑菌作用，對(duì)革蘭陰性菌（變形桿菌）的生長(zhǎng)抑制作用相對(duì)較弱，其抑菌機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3.2 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

用培養(yǎng)基配制20.0mg/mL、10.0mg/mL、5.0mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL的黃花蒿揮發(fā)油溶液，采用試管法測(cè)定樣品MIC，取完全不生長(zhǎng)管最低樣品濃度作為最低抑菌濃度，結(jié)果顯示四聯(lián)球菌、糞鏈球菌和枯草桿菌在普通培養(yǎng)基上的MIC均為5mg/mL，在M-H培養(yǎng)基上的MIC均為2.5mg/mL，而變形桿菌在普通培養(yǎng)基上的MIC為10mg/mL，在M-H培養(yǎng)基上的MIC為5mg/mL，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與濾紙片法結(jié)果相一致。

在相同試驗(yàn)條件下，根據(jù)抑菌圈直徑大小和最低抑菌濃度可以判斷M-H瓊脂培養(yǎng)基對(duì)黃花蒿揮發(fā)油抑菌作用的檢測(cè)靈敏度高。中藥抗菌試驗(yàn)一直用普通培養(yǎng)基，通過本試驗(yàn)研究結(jié)果，建議今后在中藥抗菌試驗(yàn)中采用M-H瓊脂培養(yǎng)基。

[1] 中華人民共和國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1985:166.

[2] 李偉,石崇榮.青蒿素研究進(jìn)展[J].中國藥房,2003,14(2):118.

[3] 弭向輝,龔祝南,張衛(wèi)明,等.花椒揮發(fā)油的提取、分離和抗菌實(shí)驗(yàn)[J].南京師大學(xué)報(bào),2004,27(4):63-66.