甲型H1N1流感血清流行病學(xué)研究進(jìn)展

鄭奎城,沈曉娜,楊式芹,林元波,周朝暉,謝劍鋒,陳 煒,翁育偉,嚴(yán)延生

2.福建醫(yī)科大學(xué),福州 350004;

3.福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州350001

甲型H1N1流感(甲流)病毒是4源重配病毒,由經(jīng)典豬流感病毒、歐洲豬流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒重配而成,人群對(duì)甲流病毒普遍易感。2009年6月11日,世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布將甲流流行警告級(jí)別提升為6級(jí),全球進(jìn)入流感大流行階段。2010年8月10日,WHO宣布進(jìn)入甲流大流行后時(shí)期 。根據(jù)WHO公布的數(shù)據(jù),在這段時(shí)間甲流疫情波及的國(guó)家和地區(qū)達(dá)到214個(gè),死亡病例超過(guò)18 449人[1]。根據(jù)以往大流行的經(jīng)驗(yàn),WHO預(yù)計(jì)甲流病毒還會(huì)以季節(jié)性流感病毒的表現(xiàn)方式出現(xiàn),并在今后若干年內(nèi)繼續(xù)傳播,病毒很有可能繼續(xù)使年輕人群發(fā)生嚴(yán)重疾病。各國(guó)須繼續(xù)對(duì)此保持警惕。因此,很有必要依據(jù)疾病監(jiān)測(cè)報(bào)告或血清學(xué)監(jiān)測(cè)估計(jì)和預(yù)測(cè)甲流在世界各地的流行強(qiáng)度。雖然甲流在全球廣泛流行,但由于大量輕癥患者和隱性感染的存在,疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)報(bào)告的確診病例不能反映疫情實(shí)際情況,而血清流行病學(xué)調(diào)查方法更適合于調(diào)查不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)、不同地區(qū)、不同年齡段人群的感染水平及動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)于確定甲流的感染率,血清學(xué)監(jiān)測(cè)的敏感度是臨床病例監(jiān)測(cè)的10倍以上[2]。目前甲流血清學(xué)研究以血凝抑制試驗(yàn)(HI)、微量中和試驗(yàn)(NT)為主,兩者都可以用來(lái)估計(jì)甲流流行后人群的感染率,但均有優(yōu)劣點(diǎn),以下對(duì)其研究進(jìn)展作一略述。

1 血凝抑制試驗(yàn)方法(HI)

流感病毒能夠與豚鼠、雞紅細(xì)胞或人O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集,即為紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制,即紅細(xì)胞凝集抑制現(xiàn)象。其原理是相應(yīng)的抗體與病毒結(jié)合后,阻抑了病毒表面的血凝素與紅細(xì)胞表面受體的結(jié)合。血凝抑制試驗(yàn)(HI)是目前最常用的鑒定流感病毒及流感病毒型別的方法。HI長(zhǎng)期以來(lái)被用作流感病毒感染,疫苗評(píng)價(jià),疫苗株篩選的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。該方法簡(jiǎn)單、易行、結(jié)果可靠。

1.1 紅細(xì)胞種類對(duì)HI敏感性的影響 HI的敏感性受到所使用的紅細(xì)胞種類的影響。Stephsen指出在檢測(cè)H5N1高致病性禽流感HI抗體時(shí)馬紅細(xì)胞比火雞紅細(xì)胞更敏感[3]。在Lerdsmran的研究中,為了確定以鵝紅細(xì)胞和火雞紅細(xì)胞為凝集細(xì)胞的HI試驗(yàn)是否得到可比的HI抗體滴度,6名科學(xué)家以HI抗體幾何平均滴度為1∶183的人血清為參照,以鵝紅細(xì)胞和火雞紅細(xì)胞進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明無(wú)論是鵝紅細(xì)胞或火雞紅細(xì)胞,6人得出的HI抗體滴度都為1∶160[4]。進(jìn)一步對(duì)53名甲流患者的急性期和恢復(fù)期的雙份血清及100名健康醫(yī)務(wù)人員的單份血清進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明以鵝紅細(xì)胞和以火雞紅細(xì)胞的HI試驗(yàn),兩者HI抗體滴度的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.96(Spearman's rank,P＜0.01)。HI抗體滴度≥1∶40的人數(shù)、恢復(fù)期與急性期抗體滴度比、抗體滴度呈4倍以上增長(zhǎng)的人數(shù)都相似,而且結(jié)果還顯示鵝紅細(xì)胞的血凝樣式比火雞的更清晰?；邬Z紅細(xì)胞和火雞紅細(xì)胞的HI抗體滴度有可比性,而且在東亞和東南亞地區(qū)鵝比火雞更易獲得,所以開(kāi)展HI試驗(yàn)時(shí),可用鵝紅細(xì)胞代替火雞紅細(xì)胞。

1.2 HI抗體陽(yáng)性臨界值 許多研究者以HI抗體≥1∶40作為判斷甲流感染的臨界值(cut-off value),并以此估計(jì)人群的感染率[2,5]。這個(gè)臨界值的設(shè)定是根據(jù)WHO指南,即當(dāng)流感HI抗體≥1∶40時(shí),人群中50%的人具有保護(hù)性抗體水平[6]。然而,Lerdsmran指出,7.5%的甲流患者恢復(fù)期血清HI抗體＜1∶40[4]。與此類似,Chen報(bào)道在甲流患者發(fā)病后的第25至29 d之間,7%的患者其HI抗體＜1∶40[5]。Miller等指出,在55名甲流確診患者中有6名(10.9%)HI抗體滴度低于1∶32[2]。這些結(jié)果提示若以HI抗體滴度≥1∶40衡量甲流的感染情況,可能會(huì)低估實(shí)際的感染水平。進(jìn)一步分析顯示,成人和低齡兒童HI抗體產(chǎn)生水平并不一致,應(yīng)以不同的HI抗體陽(yáng)性臨界值來(lái)判斷是否感染甲流。故在 Lerdsmran的研究中,以HI抗體≥1∶20作為低齡兒童的陽(yáng)性臨界值,而以HI抗體≥1∶40作為成人的陽(yáng)性臨界值[4]。

1.3 HI抗體與交叉反應(yīng) 甲流流行前人群是否具有一定的交叉反應(yīng)抗體,以及季節(jié)性流感疫苗對(duì)甲流病毒是否有交叉保護(hù)作用是倍受爭(zhēng)議的問(wèn)題。在Lerdsmran的研究中,對(duì)71名已接種了季節(jié)性流感疫苗對(duì)象的血清進(jìn)行甲流病毒HI試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)有8名(11.3%)HI抗體滴度在 1∶10至≥1∶40之間,其中有1(1.4%)名 HI抗體滴度為1∶80[4]。同樣,Hancock指出在2007-2009年期間注射三價(jià)滅活季節(jié)性流感疫苗的成人中,有7%的人其甲流HI抗體呈現(xiàn)4倍或以上增長(zhǎng)。然而,Kelly則指出,季節(jié)性流感疫苗對(duì)甲流無(wú)保護(hù)作用[7],但亦有其他研究者報(bào)道季節(jié)性流感疫苗對(duì)甲流有部分保護(hù)作用[8]。

有學(xué)者報(bào)道,由于既往的季節(jié)性流感暴露或疫苗接種,老年人甲流抗體呈較高水平,美國(guó)疾控中心也發(fā)現(xiàn)甲流流行前≥60歲年齡組HI抗體陽(yáng)性率在各年齡組中水平最高[9]。Hancock在報(bào)告中指出,在1980年后出生的107名對(duì)象中有4人(3.7%)其甲流HI抗體≥1∶40,而1950年前出生的115人中有39人(34%)甲流HI抗體≥1∶80。我國(guó)江蘇省曾檢測(cè)在2008年11月甲流流行前采集的632份血清,發(fā)現(xiàn)有3.64%能檢出甲流HI保護(hù)性抗體(≥1∶40)[10]。而我們先前的報(bào)告指出,在2008年人群甲流HI抗體≥1∶10和≥1∶40的陽(yáng)性率分別為6.5%和0.63%[11]。這些結(jié)果顯示,自然人群在甲流流行前存在著一定的交叉反應(yīng)抗體,可能與感染豬流感病毒或其它具有抗原交叉性的H1N1亞型流感病毒有關(guān)。但迄今為止,國(guó)內(nèi)監(jiān)測(cè)尚未發(fā)現(xiàn)類似國(guó)外報(bào)道的高年齡組人群在甲流流行前具有較高HI抗體陽(yáng)性率現(xiàn)象,這可能與甲流流行前我國(guó)流感疫苗接種率顯著低于國(guó)外有關(guān)。

1.4 HI抗體的消長(zhǎng) 甲流患者或甲流疫苗接種者的HI抗體消長(zhǎng)的相關(guān)研究還不多,但Wang在其近期的報(bào)告中指出,甲流患者在發(fā)病后的第15 d,HI抗體≥1∶40的比例從發(fā)病前的0%上升到60%,第30 d達(dá)到 100%,但在第 180 d下降為52%;而接種單價(jià)裂解甲流疫苗的人群HI抗體≥1∶40的比例則為：在接種后的第15 d從接種前的0%上升為78%,第30 d達(dá)到81%,第180 d則降為34%[12]。甲流患者在發(fā)病后的第15 d和第30 d,其HI抗體的幾何平均滴度(GMT)無(wú)顯著變化,但在第180 d GMT則從第30 d的1∶80下降為1∶52。然而,接種疫苗的對(duì)象,其GMT在第15 d為1∶100,在第30 d上升為1∶193,但在第180 d則下降為1∶74。這些結(jié)果顯示,與甲流患者相比,疫苗接種者的HI抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率低,但GMT卻顯著高而且持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。無(wú)論是經(jīng)自然感染還是通過(guò)接種疫苗獲得保護(hù)性抗體,在6個(gè)月之后約一半的調(diào)查對(duì)象喪失了抵抗甲流再次感染的免疫力。

1.5 HI抗體調(diào)查的影響因素 以血清學(xué)方法估計(jì)人群的甲流感染率受到幾個(gè)混雜因子的影響,如由于接種季節(jié)性流感疫苗引起的交叉反應(yīng),或由于人體內(nèi)存在1957年流感病毒的抗體等。此外,年齡是甲流HI抗體陽(yáng)性率的獨(dú)立相關(guān)因素。我們先前的報(bào)告也指出,在甲流流行后的各年齡組之間,無(wú)論是HI抗體≥1∶40的率還是 GMT值,均以6～17歲為最高,18～55歲次之,再次為≥56歲,而0～5歲為最低,而且各年齡組之間的差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明年齡是影響甲流HI抗體水平的因素之一[11]。這與甲流病例的分布主要以年輕人群為主相吻合。但不同性別之間抗體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明不同性別人群甲流的易感性和感染風(fēng)險(xiǎn)類似[10,13]。

2 中和抗體試驗(yàn)

病毒中和抗體試驗(yàn)(NT)是敏感而特異的血清學(xué)方法,可直接評(píng)價(jià)血清對(duì)病毒的中和保護(hù)能力,是檢測(cè)抗體與病毒作用的經(jīng)典方法。其基本原理為血清中的特異抗體與病毒的表面抗原相結(jié)合,使病毒失去感染宿主細(xì)胞的能力,從而抑制細(xì)胞病變的產(chǎn)生。由于中和抗體在血清中維持時(shí)間長(zhǎng),不能僅憑中和試驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果,作為判斷是否有相應(yīng)病毒感染的依據(jù)。

2.1 血清前處理對(duì)NT試驗(yàn)的影響 在開(kāi)展甲流的血清流行病學(xué)研究時(shí),許多實(shí)驗(yàn)室以NT試驗(yàn)作為HI試驗(yàn)的附加試驗(yàn)。在HI試驗(yàn)中,通常以霍亂菌液(RDE)對(duì)血清進(jìn)行前處理以去除血清的非特異抑制因子,但在常規(guī)NT試驗(yàn)中,一般未對(duì)血清以RDE進(jìn)行前處理[2]。Lerdsmran的結(jié)果顯示,對(duì)于無(wú)甲流HI抗體的血清,如未采取RDE處理,其NT抗體的GMT異常高,但在以RDE處理后,NT抗體的GM T與HI抗體的GM T具有可比性[4]。提示血清中的非特異抑制因子不僅能使HI試驗(yàn)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果,也能使NT試驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此,建議在以NT試驗(yàn)檢測(cè)甲流抗體時(shí),增加 RDE前處理步驟。

2.2 NT抗體與HI抗體的可比性 Lerdsmran對(duì)甲流患者發(fā)病后54 d內(nèi),每隔5 d檢測(cè)一次血清HI抗體和 NT抗體,兩種抗體的相關(guān)系數(shù)為 0.85(Spearman's rank,P＜0.0001)。HI抗體和NT抗體都呈4倍增長(zhǎng)最早出現(xiàn)在甲流發(fā)病后的第11d。在低年齡組患者中,HI≥1∶20為 100%,≥1∶40為86.1%,而NT 抗體≥1∶20為97.2%,≥1∶40為94.4%。在 44名成人患者中有 43名(97.7%)恢復(fù)期血清 HI≥1∶40,而 100%患者的NT抗體均≥1∶80。Grund等采集43名健康對(duì)象在接種甲流疫苗前與接種后第21 d的雙份血清,以NT試驗(yàn)與HI試驗(yàn)檢測(cè)其抗體水平。結(jié)果顯示,第二份血清NT抗體和HI抗體呈4倍增長(zhǎng)的比例均為95.3%,而且兩種抗體的GMT及其增長(zhǎng)幅度都呈很好的可比性[13]。這些結(jié)果表明,NT試驗(yàn)在評(píng)價(jià)甲流感染后或疫苗接種后抗體的水平變化與HI試驗(yàn)有良好的可比性。

2.3 NT抗體與交叉反應(yīng) Hancock指出,在接種季節(jié)性流感疫苗的成人中有7%的人其甲流HI抗體呈現(xiàn)4倍或以上增長(zhǎng),而甲流NT抗體陽(yáng)性率(≥1∶40)則高達(dá)22%[9]。Lerdsmran[4]也指出,在已接種了季節(jié)性流感疫苗的對(duì)象中,有11.3%的人其HI抗體在1∶10至≥1∶40之間,有1.4%的人高于1∶80,而NT抗體≥1∶40的比例則高達(dá)22.5%。Mark等在香港開(kāi)展的血清學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn),在≥65歲以上年齡組人群中,有37%的人在甲流大流行前其NT抗體≥1∶40[14]。說(shuō)明與HI抗體相比,甲流NT抗體與季節(jié)性流感的交叉反應(yīng)更廣。

由于HI抗體僅與流感病毒的血凝素受體結(jié)合,而NT抗體可與更廣范圍的病毒受體結(jié)合,所以相對(duì)于 HI抗體而言,NT抗體反應(yīng)更廣、更敏感[15-16],正由于這個(gè)特點(diǎn),甲流NT抗體與季節(jié)性流感病毒或疫苗的交叉反應(yīng)顯得更高,特別是在50歲以上的接種疫苗者中,其血清NT抗體顯示出高度交叉反應(yīng)[4,9,13]。此外,NT抗體在血清中維持時(shí)間長(zhǎng),因此,若以NT抗體≥1∶40作為判斷甲流感染的臨界值,并以此估計(jì)人群的感染率,可能會(huì)導(dǎo)致感染率的高估。所以,甲流NT抗體陽(yáng)性臨界值的設(shè)定,還須進(jìn)一步研究,以準(zhǔn)確評(píng)估甲流的感染率。

3 展 望

目前甲流病毒以季節(jié)性流感病毒的表現(xiàn)方式出現(xiàn),在某些地區(qū)形成一定規(guī)模的流行,依然威脅人們的健康。血清流行病學(xué)研究可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)甲流在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)、不同地區(qū)、不同年齡組人群的感染水平及動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。除了HI和 NT試驗(yàn)以外,酶免疫實(shí)驗(yàn)法(EIA)和以ELISA為基礎(chǔ)的微量NT試驗(yàn)也逐步得以應(yīng)用,這些方法更便捷快速,但其敏感度和特異度仍有待進(jìn)一步探討。

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