實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)工作中存在的問題及建議

張麗芳

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心，北京 100021）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要指標(biāo)，隨著生命科學(xué)研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量不斷提出新的更高要求，已有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)體系已不能完全適應(yīng)其發(fā)展的需求，現(xiàn)將我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中存在的問題及建議分述如下：

1 我國(guó)細(xì)菌檢測(cè)項(xiàng)目不全，難以對(duì)動(dòng)物質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確客觀的評(píng)價(jià)

與國(guó)際上多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比［1-7］，以下病原微生物未列入我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目，這些病原缺乏基礎(chǔ)性研究，未建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)能力的不足造成難以對(duì)動(dòng)物質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確客觀的評(píng)價(jià)。

（1）螺桿菌（Helicobacter spp）：螺桿菌的宿主范圍非常廣泛，包括整個(gè)哺乳類動(dòng)物、禽類、家畜、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和海洋生物如鯨魚等，引起各種癥狀包括癌癥的疾?。?］。目前從大鼠、小鼠、沙鼠。

等嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中已陸續(xù)分離到至少13種嚙齒動(dòng)物螺桿菌［9］，其中重要的有H.bilis，H.hepaticus，H.rodentium，H.typhlonius，H.trogontum，H.gammani。嚙齒動(dòng)物螺桿菌能導(dǎo)致小鼠肝炎、肝細(xì)胞瘤、盲腸結(jié)腸炎、膽管炎、肝膽腫瘤等多種腸肝疾病［10-13］，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量。更重要的是，感染螺桿菌的動(dòng)物用于人類消化道疾病研究，以及藥品、保健食品、化妝品等安全性評(píng)價(jià)時(shí)，其結(jié)果將受到干擾。螺桿菌在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有較高的感染率，如2001～2005年間，亞洲、歐洲及北美洲不同來源的34個(gè)實(shí)驗(yàn)小鼠群中有30個(gè)感染螺桿菌，陽(yáng)性率為88％［9］；我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也存在該類螺桿菌感染［14］，對(duì)北京市部分清潔級(jí)大鼠、小鼠和沙鼠檢測(cè)結(jié)果表明，螺桿菌帶菌率幾乎為100％［15］。國(guó)外已將螺桿菌作為嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原菌列入常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，PCR方法和測(cè)序是目前螺桿菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)已陸續(xù)開展螺桿菌檢測(cè)方法的研究［14-16］。

（2）CAR桿菌（Cilia-associated respiratory bacillus，CAR）：CAR桿菌首先分離自實(shí)驗(yàn)大鼠，隨后從實(shí)驗(yàn)小鼠、兔、豬、山羊、牛、羚羊、鹿、狍等多種動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)［17-22］，引起大、小鼠慢性呼吸道疾病，多與肺支原體和病毒協(xié)同感染，引起細(xì)支氣管擴(kuò)張、化膿性支氣管炎、氣管炎，肺膿腫、肺不張，檢測(cè)方法有血清學(xué)、PCR、組織病理學(xué)。CAR桿菌不能在無活細(xì)胞的人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這種生物學(xué)特性給該菌的檢測(cè)帶來一定困難，不同來源菌株差異很大，兔株和大鼠株16SrRNA序列同源性僅達(dá)48.8％［23］，菌株的差異使分子生物學(xué)方法如PCR在我國(guó)也無法開展。我國(guó)沒有將其列為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)該菌的研究基本為空白，缺乏病原學(xué)、流行病學(xué)資料。

（3）牛棒狀桿菌（Corynebacterium bovis，C.bovis）：牛棒狀桿菌是裸鼠角化過度性皮炎、棘皮癥的病原［24］，發(fā)病裸鼠背部及兩側(cè)出現(xiàn)鱗片樣小白點(diǎn)，此病為一過性，但傳播迅速，幾天內(nèi)發(fā)病率達(dá)80％，乳鼠死亡率相當(dāng)高，Scid成年小鼠也可致病［25］。C.bovis是國(guó)外免疫缺陷小鼠必檢項(xiàng)目，檢測(cè)方法為分離培養(yǎng)法，國(guó)內(nèi)未見相關(guān)的研究報(bào)告。

（4）嚙齒檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium，C.rodentium）：美國(guó)、日本爆發(fā)流行以小鼠降結(jié)腸嚴(yán)重增厚為病理特征的傳染性鼠結(jié)腸增生癥，造成乳鼠中等死亡率，病原分離證實(shí)為嚙齒檸檬酸桿菌（曾用名非典型性檸檬酸桿菌，弗氏檸檬酸桿菌4280），是檸檬酸桿菌屬中唯一分離自小鼠的基因種。近年來嚙齒檸檬酸桿菌成為研究的熱點(diǎn)不僅僅是其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的影響，嚙齒檸檬酸桿菌是目前所知唯一與人類腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicE.coli，EHEC）和腸致病性大腸桿菌（enteropathogenicE.coli，EPEC）擁有相同Lee毒力島的鼠類自然病原［26-28］。C.rodentium與致病性大腸桿菌在生物學(xué)特性上相似，在日本曾經(jīng)被歸為小鼠的致病性大腸桿菌O115血清型，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中列為必要時(shí)檢測(cè)的項(xiàng)目的大腸桿菌O115 a，C，K（B）（Escherichia coliO115 a，C，K（B））為C.rodentium的一種，國(guó)標(biāo)中推薦的檢測(cè)方法僅僅針對(duì)于Escherichia coliO115 a，C，K（B），因此對(duì)C.rodentium在我國(guó)的影響程度尚不得而知。

2 部分檢測(cè)方法特異性、敏感性不高，檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)化不足

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中雖然對(duì)各種微生物均提出一種或多種檢測(cè)方法，但對(duì)具有一定難度的病原微生物檢測(cè)技術(shù)，僅停留在引用已有的基本方法，滿足常規(guī)檢測(cè)的水平上，致使將某些可操作性較差的方法寫入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，部分項(xiàng)目檢測(cè)試劑的供應(yīng)和試劑標(biāo)準(zhǔn)化嚴(yán)重不足，某些項(xiàng)目的檢測(cè)在實(shí)際工作中無法實(shí)施，或由于方法自身的問題導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量檢測(cè)工作缺乏可信性和可靠性，阻礙了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施。以下病原雖然列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目，由于檢測(cè)方法缺陷使檢測(cè)結(jié)果可信度不高：

（1）泰澤病原體（Clostridium piliforme）：目前泰澤病原體感染尚無可靠的診斷方法。歐美對(duì)該菌常用的檢測(cè)方法有血清學(xué)（MFI、ELISA、IFA）、分子生物學(xué)（PCR）和組織病理學(xué)等方法，我國(guó)已將IFA作為常規(guī)檢測(cè)方法應(yīng)用于泰澤病原體檢測(cè)，由于難以純化診斷抗原，ELISA方法還未開展。泰澤病原體是近年來國(guó)內(nèi)外檢出率較高的細(xì)菌之一，西歐2000-2003年間實(shí)驗(yàn)大鼠泰澤抗體陽(yáng)性率高達(dá)65％［29-31］。我國(guó)清潔級(jí)大鼠泰澤抗體陽(yáng)性率達(dá)50％左右，但追蹤抗體連續(xù)陽(yáng)性的動(dòng)物群均未發(fā)現(xiàn)任何臨床癥狀（未發(fā)表資料），而且大鼠陽(yáng)性率顯著高于小鼠。病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)的相符性，病原確切的體內(nèi)規(guī)律均需深入研究。

（2）支原體（Mycoplasma spp）：支原體為我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中必須檢測(cè)項(xiàng)目，分離培養(yǎng)法和ELISA方法為我國(guó)國(guó)標(biāo)推薦的支原體檢測(cè)方法，由于缺乏診斷試劑，各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室多使用分離培養(yǎng)法，但多年未見檢出報(bào)道；國(guó)外多采用血清學(xué)方法（ELISA、IFA、MFI）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺支原體（Mycoplasma pulmonis，M.pulmonis）感染的檢測(cè)，大小鼠肺支原體陽(yáng)性的報(bào)道近年來屢見不鮮，被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最常見的污染菌之一。2007-2008年西歐實(shí)驗(yàn)大鼠肺支原體抗體陽(yáng)性率達(dá)3.6％，小鼠抗體陽(yáng)性率為0.08％［32］。韓國(guó)2006-2007年56個(gè)研究機(jī)構(gòu)和8個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的小鼠，肺支原體抗體陽(yáng)性率為1.8％［33］，支原體檢測(cè)方法的改進(jìn)已是迫在眉睫的工作。

（3）念珠狀鏈桿菌（Streptobacillus moniliformis，S.moniliformis）：念珠狀鏈桿菌對(duì)人、實(shí)驗(yàn)小鼠、非人靈長(zhǎng)類等動(dòng)物有極強(qiáng)的致病性，美國(guó)和加拿大等國(guó)已將其作為致死性人獸共患病列入了新發(fā)感染性疾病的范疇［34］。國(guó)外均采用PCR方法作為S.moniliformis常規(guī)檢測(cè)方法［1-7］，而我國(guó)仍采用分離培養(yǎng)法對(duì)念珠狀鏈桿菌進(jìn)行檢測(cè)，其培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求高、生長(zhǎng)緩慢、生化反應(yīng)不活潑、高度多形性、染色特性不穩(wěn)定和極易形成L型等特點(diǎn)，上述生物學(xué)特性采用分離培養(yǎng)法極易造成假陰性結(jié)果，檢測(cè)方法在念珠狀鏈桿菌感染的控制方面顯得尤其重要。

我國(guó)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)取材部位較單一，如呼吸道病原的檢測(cè)部位僅為氣管會(huì)厭部，而Taconic除此之外還選取鼻咽沖洗物和抽取中耳內(nèi)容物，大大提高了檢出率［1］。

3 檢測(cè)頻率單一，缺乏靈活性

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定小動(dòng)物檢測(cè)頻率是3個(gè)月，而國(guó)外檢測(cè)頻率是根據(jù)病原特性確定的，分別為2～4、4、12、26、52周。國(guó)內(nèi)近年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見污染菌為金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、泰澤病原體，根據(jù)本地的感染譜、病原特性和檢測(cè)方法的敏感性，調(diào)整監(jiān)測(cè)計(jì)劃，增加易感菌的檢測(cè)頻率，既保證動(dòng)物質(zhì)量，又可節(jié)省經(jīng)費(fèi)，使檢測(cè)工作在確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量方面起到應(yīng)有的作用。

4 現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)取樣要求不適用于特殊動(dòng)物檢測(cè)，應(yīng)建立哨兵動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的動(dòng)物取樣數(shù)量和取樣方法是針對(duì)相同飼養(yǎng)條件的動(dòng)物群體而言，并不適用于基因工程動(dòng)物和飼養(yǎng)于特殊設(shè)施內(nèi)的動(dòng)物。

近年來，轉(zhuǎn)基因、基因突變、基因敲除等基因工程動(dòng)物的數(shù)量和種類迅速增多，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在各研究機(jī)構(gòu)的流通，其后果是一些多年前消滅的病原微生物如螨和蟯蟲等重新出現(xiàn)，基因工程動(dòng)物創(chuàng)制過程中所使用細(xì)胞及生物制品污染可能使動(dòng)物群全軍覆滅［35］。如何對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，在最大程度上保證這類造價(jià)高，群體小而可能風(fēng)險(xiǎn)大的動(dòng)物群體質(zhì)量，已引起人們的高度重視。加之各種小型的相對(duì)獨(dú)立的動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)備應(yīng)用于各研究機(jī)構(gòu)，增加了監(jiān)測(cè)程序尤其是動(dòng)物取樣數(shù)量的復(fù)雜性。

上述問題都可通過放置哨兵動(dòng)物解決，國(guó)外對(duì)哨兵動(dòng)物進(jìn)行了諸多研究［36］，我國(guó)在這方面還是空白。FELASA明確規(guī)定了哨兵動(dòng)物年齡、性別、在各種設(shè)施中放置的位置等，為我國(guó)基因工程動(dòng)物的檢測(cè)提供了借鑒［7］。

5 缺乏新資源的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)測(cè)體系

隨著生命科學(xué)研究的迅猛發(fā)展，新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源不斷被開發(fā)，并逐步應(yīng)用于生命現(xiàn)象和人類疾病研究。已有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)體系不能完全適應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新資源開發(fā)利用的需求，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)滯后和檢測(cè)手段不完善已成為制約實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新資源開發(fā)、標(biāo)準(zhǔn)化研究與推廣利用的瓶頸，建立和制定新資源的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)體系，是今后一段時(shí)期內(nèi)的研究重點(diǎn)。

6 建議

6.1 完善標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際化

為保證我國(guó)生命科學(xué)領(lǐng)域中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在國(guó)際上具有可比性、得以公認(rèn)，為使我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能夠參與國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物商品流通，可制定地方和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，加入Helicobacter.spp、CAR桿菌、C.bovis、C.rodentium等病原菌的的檢測(cè)項(xiàng)目，使我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際接軌。制定哨兵動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。

6.2 增加特殊動(dòng)物的微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

各國(guó)微生物監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)均規(guī)定不同等級(jí)動(dòng)物應(yīng)排除的病原微生物，這并不完全適用于基因工程動(dòng)物。人工導(dǎo)致的基因突變可能改變動(dòng)物的免疫應(yīng)答反應(yīng)，基因工程動(dòng)物可出現(xiàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之外的人類了解很少的微生物引起的臨床感染，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能鑒定用于生物醫(yī)學(xué)研究動(dòng)物相關(guān)的所有微生物，即了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶的所有菌群，這對(duì)檢測(cè)人員的檢測(cè)能力提出了更高的要求。

6.3 加強(qiáng)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化研究，提升監(jiān)測(cè)能力

對(duì)未列入我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的病原菌和檢測(cè)方法有缺陷的病原菌如Clostridium piliforme、Mycoplasmaspp、S.moniliformis等開展病原學(xué)、流行病學(xué)和診斷方法的研究，建立切實(shí)可行的檢測(cè)方法。

根據(jù)生物學(xué)特性、表型特征鑒定細(xì)菌的傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的檢測(cè)方法，相對(duì)于血清學(xué)方法而言，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)很難標(biāo)準(zhǔn)化，各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所用培養(yǎng)基、檢測(cè)程序、培養(yǎng)條件及檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)的差異導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的差異［37］；國(guó)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)已采用各種全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，大大提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性，縮短了鑒定時(shí)間。過去20年中，細(xì)菌分類學(xué)發(fā)生了巨大變化，16S rDNA代替細(xì)菌表型分類法作為《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）細(xì)菌菌種分類的客觀基礎(chǔ)，在各級(jí)分類單位中全面應(yīng)用核酸研究，在表型特征的基礎(chǔ)上，以DNA資料給予決定性的判斷。當(dāng)表型鑒定為致病菌時(shí)，鑒定結(jié)果應(yīng)用16S rDNA測(cè)序等分子生物學(xué)方法確認(rèn)，相對(duì)表型鑒定方法，16S rDNA測(cè)序鑒定細(xì)菌更準(zhǔn)確和客觀。這并不意味著表型鑒定方法陳舊過時(shí)，模棱兩可的的表型和基因結(jié)果可能意味著新種的發(fā)現(xiàn)。與國(guó)外相比，分子生物學(xué)技術(shù)在國(guó)標(biāo)中應(yīng)用較少，我國(guó)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)將PCR等分子生物學(xué)方法納入監(jiān)測(cè)能力范圍之內(nèi)，對(duì)提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)能力和檢測(cè)技術(shù)水平將發(fā)揮重要作用。

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